不结球白菜感染菌核病后4个生理生化指标分析

选用4个对菌核病具有不同抗性的不结球白菜品种003-R-6、Y3-R-4、109-S-9和003-S-7为试验材料,于四叶一心期接种核盘菌,采用苗期琼脂块叶片接种法测定各品种对菌核病的抗性,并分别测定接种前后叶片中4个生理生化指标。结果表明,苗期琼脂块叶片接种法与田间自然诱发鉴定结果相一致,可有效反映抗、感品种的差异。在核盘菌影响下,4个抗、感病品种中不结球白菜的丙二醛(MDA)含量、游离氨基酸(FAA)总量、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性均有所变化。其中丙二醛(MDA)含量、游离氨基酸(FAA)总量表现为感病品种增加幅度大于抗病品种,而几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性均表现为抗病品种增加幅度大于感病品种,说明各指标与品种抗病性强弱存在一定的相关性。     

不结球白菜感染菌核病后4个生理生化指标分析

选用4个对菌核病具有不同抗性的不结球白菜品种003-R-6、Y3-R-4、109-S-9和003-S-7为试验材料,于四叶一心期接种核盘菌,采用苗期琼脂块叶片接种法测定各品种对菌核病的抗性,并分别测定接种前后叶片中4个生理生化指标。结果表明,苗期琼脂块叶片接种法与田间自然诱发鉴定结果相一致,可有效反映抗、感品种的差异。在核盘菌影响下,4个抗、感病品种中不结球白菜的丙二醛(MDA)含量、游离氨基酸(FAA)总量、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性均有所变化。其中丙二醛(MDA)含量、游离氨基酸(FAA)总量表现为感病品种增加幅度大于抗病品种,而几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性均表现为抗病品种增加幅度大于感病品种,说明各指标与品种抗病性强弱存在一定的相关性。     

甘蓝型油菜LOX2基因在MeJA、BTH和核盘菌诱导下的表达

利用荧光定量PCR技术,检测了甘蓝型油菜脂氧合酶基因LOX2在化学激素(MeJA和BTH)处理和核盘菌(Sclertinia sclerotiorum)接种后的表达差异,以及核盘菌诱导处理后LOX2基因在不同油菜菌核病抗性品种中的表达差异.结果显示:MeJA处理后,LOX2基因的表达水平在24 h达到最高,是处理前的30.3倍,表明LOX2基因的表达受MeJA诱导;相反,LOX2基因的表达受水杨酸类似物BTH的明显抑制.进一步研究表明:LOX2基因在核盘菌接种后期明显诱导上调表达,接种72 h后在高抗品种D083、中高抗品种ZS9和高感品种84039的表达量分别为接种前的5.0倍、2.7倍和1.7倍.因此,初步推测LOX2基因的高表达在油菜对菌核病抗性中起重要作用,参与了茉莉酸介导的菌核病抗性防御反应.     

不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的克隆及表达分析

[目的]本文旨在研究不结球白菜病程相关蛋白基因Bc PR5的结构与表达特征。[方法]通过RACE技术,从抗病品种‘苏州青’叶片克隆到Bc PR5基因的全长c DNA序列。采用RT-q PCR方法分析该基因在霜霉病菌诱导,水杨酸(SA)、茉莉酸(Me J)和脱落酸(ABA)等激素处理条件下的表达模式。SDS-PAGE技术分析该基因的原核表达特征。[结果]Bc PR5基因的c DNA全长为954 bp,其中开放阅读框长度为732 bp,共编码243个氨基酸,相对分子质量为26.1×103,理论等电点是9.3。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜Bc PR5基因与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜第6号染色体上的基因同源性最高(100%)。RT-q PCR分析表明,抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’在霜霉病菌和非生物胁迫(SA、Me J和ABA)诱导过程中,Bc PR5基因的表达量均呈先升高后降低的趋势,且抗病品种高于感病品种。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后能实现融合蛋白的高效表达。[结论]Bc PR5在不结球白菜抗霜霉病防御反应中发挥着重要作用,研究结果为该基因的功能验证提供理论基础。     

不结球白菜BcOPR3基因的克隆与功能分析

[目的]12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸生物合成途径的关键酶,催化12-氧-植物二烯(OPDA)还原反应生成茉莉酸化合物,广泛参与植物生长过程中的防御系统。本文旨在克隆和研究不结球白菜Bc OPR3基因,研究其对信号分子和非生物胁迫应答的影响。[方法]对不结球白菜OPR3基因进行克隆、生物信息分析、亚细胞定位,并对其在霜霉病菌、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、机械伤害、低温和热激胁迫下的表达水平进行了分析。[结果]Bc OPR3在2个不结球白菜品种中的序列一致,其Bc OPR3蛋白与同科油菜(Brassica napus)的同源性高达98%,进化关系与之最相近;亚细胞定位结果显示Bc OPR3定位在细胞膜上;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测结果表明,不结球白菜霜霉病菌、ABA、JA、SA、机械伤害、低温和热激胁迫均能诱导Bc OPR3基因表达。霜霉病菌侵染下,Bc OPR3在抗性自交系‘苏州青’和感病自交系‘矮脚黄’中存在差异表达,并且在抗病自交系中表达量较高。[结论]从不结球白菜克隆得到的Bc OPR3,通过表达分析发现,Bc OPR3可能存在对非生物胁迫的共响应,且在不结球白菜中该基因是在细胞膜上起作用。在非生物胁迫下,基因具有不同的应答模式,抗性自交系Bc OPR3基因的高表达是其具有更高抗性的主要原因。     

不同浓度信号分子诱导的小麦TaLr19TLP1基因的表达分析

为了明确脱落酸(Abscisic acid,ABA)、水杨酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)、乙烯(Ethephon,ETH)等信号分子对小麦TaLr19TLP1基因表达的调控作用,在前期研究的基础上,利用半定量RT-PCR对ABA、SA、MeJA和ETH处理后TcLr19小麦中TaLr19TLP1基因表达模式进行分析。结果表明:不同浓度信号分子诱导后不同时间点,TaLr19TLP1基因表达趋势一致,但表达量差异显著。0.5mmol/L ABA、0.5mmol/L SA、0.05mmol/L ETH、0.1mmol/L MeJA诱导后,TaLr19TLP1基因表达高峰出现较早,表达量显著高于相同信号分子其他浓度处理。其中,不同浓度ABA诱导后,TaLr19TLP1基因在不同时间点表达量差异最明显。TaLr19TLP1基因在ETH诱导后6h出现表达高峰,在ABA,MeJA诱导后12h达到表达高峰,在SA诱导后48h出现表达高峰。研究表明,该基因表达受脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯等信号分子的不同程度的诱导,乙烯最先诱导表达,并明确0.5mmol/L ABA、0.5mmol/L SA、0.05mmol/L ETH、0.1mmol/L MeJA为相对最佳诱导浓度。     

水杨酸诱导不结球白菜抗黑斑病机制的探讨

以不结球白菜感黑斑病品种短白梗为材料,于两叶一心期用05mmol·L-1水杨酸(SA)进行叶面喷雾处理,用半定量RT-PCR技术检测叶片中Bcchi、BcPR4、BcAF基因的表达变化,并在SA处理后24 h接种甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola),研究抗病相关物质的变化,以探讨SA 诱导的抗病机制.结果表明,SA喷雾处理后显著诱导了BcAF、BcPR4、Bcchi在短白梗中的表达;接种后,经SA处理的短白梗中,48 h前SOD活性、12 h后POD活性、48 h前PPO活性和0～12 h与84 h后H2O2含量均高于未经处理的,而CAT活性在处理36h后低于未经处理的.用SA 对短白梗进行喷雾处理可明显降低其病情指数,表明SA诱导系统获得性抗性在提高黑斑病抗性方面起到重要作用.     

壳寡糖诱导油菜抗菌核病机理研究初探

壳寡糖作为一种有效的生物农药已被应用于多种农作物,田间使用发现其可诱导油菜抗油菜菌核病,但机理不甚明了。本试验证明此诱抗有时间依赖性,接种核盘菌前提前3 d用50μg/mL浓度壳寡糖预处理的植株有最佳防治效果,防效高达72.1%。而平板抑菌试验证明壳寡糖对核盘菌的生长没有直接抑制作用,说明油菜对菌核病的抗性来源于壳寡糖激发的植物自身系统抗性。利用半定量RT-PCR检测发现油菜中重要的抗性基因BnPDF1.2可被壳寡糖诱导表达水平升高,壳寡糖还可以诱导茉莉酸生成途径中关键酶脂氧合酶(LOX)的活性升高,说明壳寡糖诱导油菜抗菌核病可能由JA/ET途径介导。     

油菜BnPMEI1基因的克隆及功能分析

以高抗菌核病的油菜品种湘油15和高感菌核病的油菜品种98C40为材料，采用RT–PCR方法克隆BnPMEI1基因的编码区全长，利用生物信息学软件和实时荧光定量PCR分析BnPMEI1的结构和表达特性，并构建该基因超表达载体，分析该基因的功能。序列分析结果表明，该基因编码区全长615bp，编码204个氨基酸，具有1个信号肽和1个PMEI结构域，属于PMEI家族基因，命名为BnPMEI1(GenBank登录号为ON254917)。表达分析结果表明，BnPMEI1在根、茎、花、叶、角果皮和籽粒中均有表达，在叶中的表达量最高，根中的表达量最低；湘油15的茎、叶、花中的表达量均显著高于98C40的。在核盘菌、茉莉酸甲酯(Me JA)和水杨酸(SA)处理下，BnPMEI1在湘油15中的表达上调，在98C40中的表达则受到抑制；乙烯处理下，BnPMEI1在2个品种中的表达均下调，在湘油15中下调的幅度更大；离体叶片接种结果显示，超表达Bn PMEI1的油菜突变体叶片病斑明显小于野生型叶片的。综合分析，BnPMEI1基因可能介导了SA和茉莉酸途径的调控，诱导油菜菌核病抗性的提高。     

不结球白菜过氧化还原蛋白基因Brc2-Cys Prx的克隆和表达分析

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结球白菜叶片Brc2-Cys Prx基因在霜霉病菌侵染及NaCl、CdCl_2、PEG6000和ABA等非生物胁迫处理条件下的表达模式进行研究。[结果]Brc2-Cys Prx基因的c DNA全长为999 bp,其中开放阅读框长度为810 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子质量为28.15×10~3,理论等电点为5.87。不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。该蛋白含有1个PRX_Typ2cys结构域,属于硫氧还蛋白超家族。系统进化分析表明:不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜和甘蓝型油菜进化关系最近。霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx基因表达呈逐渐上调趋势,在‘矮脚黄’中的表达与‘苏州青’相比上调迟钝,且该基因在‘矮脚黄’中的表达量一直低于‘苏州青’。0.2 mol·L~(-1)NaCl和200 g·L~(-1)PEG6000处理抑制Brc2-Cys Prx基因的表达;150μmol·L~(-1)CdCl_2处理促进Brc2-Cys Prx基因的表达,在24 h达到最大值;100μmol·L~(-1)ABA处理后,Brc2-Cys Prx基因表达上调,而12 h后,表达受抑制。[结论]霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx在抗性系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’中的表达存在差异,并且在抗病系中的表达量较高,推测Brc2-Cys Prx基因的高转录水平是抗病品种较之感病品种对霜霉病菌侵染具有更高抗性的原因之一。在非生物胁迫条件下,Brc2-Cys Prx基因具有不同的应答模式,推测可能是涉及到不同的物质或信号途径的原因。     

巴西橡胶树HbMlo9基因的功能

Mlo基因是一种负向调控植物防卫机制的基因。为了解巴西橡胶树HbMlo9基因的功能,通过基因表达分析,探究HbMlo9基因在橡胶树不同组织中的表达情况,以及在机械损伤、干旱、白粉菌、脱落酸(ABA)、乙烯利(ETH)、茉莉酸(MeJA)和过氧化氢(H_2O_2)处理下的表达模式。结果表明:HbMlo9基因主要在树皮和花中表达,在胶乳和树叶中表达量较低。在处理早期机械伤害会诱导该基因显著上调表达。在干旱处理下该基因表现出复杂的应答模式。白粉菌侵染不能诱导HbMlo9基因表达量发生变化。ABA、ETH、MeJA和H_2O_2处理早期,该基因表达水平显著上调,随后显著下调。这说明HbMlo9基因参与橡胶树的激素信号传导以及逆境响应过程,但不参与抗白粉病作用机制。     

甲基茉莉酸和草酸诱导油菜BN10基因的表达

利用实时荧光定量PCR方法,观察油菜BN10基因在根、茎、叶中的表达差异,并分析甲基茉莉酸(MeJA)和草酸(OA)对该基因的诱导表达的动态变化。结果表明:BN10基因在油菜根、茎、叶中均能表达,其中在根中的表达量最高,茎中的表达量次之,在叶中的表达量最低,且在抗病毒品种苏油1号中的表达量高于感病品种中双9号;BN10的表达受MeJA和OA的诱导影响。MeJA诱导处理感病品种中双9号叶片后,BN10基因表达先升后降,在24h时表达量最高,为诱导前的2.58倍,之后有所下降,但诱导后的表达量始终高于诱导前,72h时的表达量仍为诱导前的1.13倍;OA诱导处理中双9号后,BN10表达量也是先增加后降低,在12h时达到最大值,为诱导前的2.5倍,72h时下降至最低,仅为诱导前的25%。MeJA诱导处理抗病品种苏油1号后,BN10的表达趋势与中双9号相似,但各时间点的表达量均高于中双9号;OA诱导处理苏油1号后,对BN10的诱导更强烈,表达量在6h时即达到峰值,为诱导处理前的3.05倍,之后逐渐下降。     

不同烟草品种响应TMV病程和SA涂抹中ABA的时空变化

以筛选出的抗性资源HZNH和Xanthi-nc为抗性材料,以品种K358为感病材料,建立烟草对TMV的抗感实验系统。研究它们在SAR(systemic acquired resistance)过程中响应TMV病程中信号分子的时空变化。利用抗体检测SAR过程中烟草内源ABA含量变化,发现接种TMV能够诱导烟草内源抗病品种Xanthi-nc具有较高的内源ABA含量,并在处理后能够大幅度上升;抗病品种HZNH具有较高的内源ABA含量,在处理后上升幅度不大;感病品种K358内源ABA含量较低,在处理后上升幅度介于2个抗病品种之间。     

Ca2＋信号通路对本氏烟叶位介导的核盘菌抗性的影响

组合采用药理学、分子生物学和反向遗传学等技术,分析叶位对本氏烟抗核盘菌( Sclerotinia sclerotiorum)的影响及其机制。结果表明,叶位显著影响本氏烟对核盘菌的抗性,随着叶位自上而下,该抗性逐渐增强。药理学分析结果显示,Ca2＋通道抑制剂 LaCl3和 NaVO3处理消除了本氏烟叶片对核盘菌抗性的叶位间差异。定量反转录聚合酶链反应检测结果显示,3个 Ca2＋信号通路基因 NbCNGC20、NbCA M TA3和 NbCML1在本氏烟不同叶位叶片中的表达存在显著差异,随着叶位自上而下逐渐增加。病毒诱导的基因沉默( virus‐induced gene silencing ,VIGS)分析结果表明,钙调素类似蛋白基因 NbCML1的沉默导致叶位介导的本氏烟对核盘菌抗病性的丧失。这些结果说明叶位对本氏烟抗核盘菌具有显著影响,揭示了包括 NbCML1基因在内的 Ca2＋信号通路对叶位介导的核盘菌抗性的重要调控作用。     

外源水杨酸(SA)对不结球白菜根肿病的抗性诱导效应

以不结球白菜‘新矮青'为试材,在种子、子叶期、一叶一心期、三叶一心期灌施外源水杨酸(SA),研究0.2—0.8 mmol/LSA对不结球白菜植株根肿病发病和感病植株生长的影响,探讨外源SA防治不结球白菜根肿病的可行性。结果表明:适宜浓度的外源SA能够不同程度降低根肿病的发病率和病情指数,缓解感病不结球白菜生长的抑制作用。不同处理时期均存在剂量效应,种子、子叶期、一叶一心期、三叶一心期的最佳SA处理浓度分别为0.8 mmol/L、0.4 mmol/1、0.6 mmol/L、0.6 mmol/L。综合分析各处理组合下植株发病情况和感病植株生长情况,认为一叶一心期0.6 mmol/LSA对不结球白菜根肿病的抑制效果最好。     

低温胁迫下外源激素对番茄SlMYB102转录因子表达量的影响

探讨在低温胁迫下,6种外源激素对番茄转录因子SlMYB102基因表达量的影响。对长至四叶一心的番茄幼苗进行外源激素喷施和低温处理,激素处理采用水杨酸(SA)、生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)进行叶面喷施,以喷施去离子水作为对照。分别在4℃低温处理后的0、1、3、6、9、12、24 h取样,利用实时荧光定量PCR法检测番茄转录因子SlMYB102基因的表达情况。结果表明,在ABA、GA3、IAA、SA、6-BA、MeJA的诱导下,SlMYB102基因对6种激素均有响应,并呈上调表达模式。SlMYB102转录因子作为MYB家族中R2R3-MYB亚家族的一员,可能参与这些激素对于逆境胁迫的调控网络。     

陕西汉中地区抗菌核病油菜材料检测

菌核病是由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起的一种严重危害油菜的真菌病,选育和推广抗病品种是控制油菜菌核病最安全、经济和环保的途径。本研究在陕西汉中地区采用人工牙签茎秆接种法,于油菜初花期对17份不同抗性的自交系油菜材料开展连续3年的核盘菌接菌试验。结果表明:田间接种方法能够准确有效地对油菜品系菌核病抗性进行筛选和鉴定,试验材料抗病性介于高抗-高感之间,筛选出5份抗菌核病油菜材料。本研究结果可为菌核病抗性研究及抗菌核病油菜品种选育提供参考。     

人工合成高抗菌核病甘蓝型油菜几种关键酶编码基因的表达与其抗性的关系

【目的】研究人工合成高抗菌核病甘蓝型油菜RB165的几种关键酶编码基因与菌核病抗性的关系。【方法】以RB165及其野生甘蓝抗病亲本BP（Brassica incana）和耐、感病甘蓝型油菜为试材,离体鉴定叶、茎菌核病抗性,并用qRT-PCR对4个病程相关基因（OXO、Cu/Zn SOD、PR2和PR3）在叶片接种0、6、12、24、36 h的表达进行检测。【结果】参试材料叶片和茎杆的抗病性达到极显著正相关（r = 0.93）; RB165的抗病性低于RP,但极显著高于耐、感病品（种）系;接种核盘菌后,OXO的表达被抑制,Cu/Zn SOD的表达则先下降后上升,PR2的表达出现2次峰值,PR3的表达被剧烈诱导,4个基因在不同材料间的相对表达量差异极显著,但变化规律相似。【结论】RB165的抗病性强于耐病甘蓝型油菜,但几种酶编码基因受核盘菌的诱导表达与菌核病抗性没有直接关系。     

热激诱导不结球白菜热激蛋白合成与耐冷性分析

以不结球白菜暑绿为试材,研究了热激处理(42℃)诱导不结球白菜热激蛋白(BcHSP)合成与耐冷的相关性。结果表明:热激处理明显增强了不结球白菜幼苗的耐冷性,降低了膜伤害程度。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性含量增加,而丙二醛(MDA)含量下降。已从热激诱导的不结球白菜中克隆了小分子量BcHSP基因(日本DNA数据库DDBJ登录号:AB367955)。荧光实时定量PCR分析表明BcHSP的表达量与耐冷性相一致。低温(4℃)胁迫下,在大肠杆菌中异源表达BcHSP可维持大肠杆菌较高的细胞活力,这些结果表明BcHSP合成与不结球白菜耐冷性的提高有关。     

芜菁花叶病毒对不结球白菜内源激素含量及代谢相关基因转录水平的影响

以不结球白菜感病品种‘矮脚黄’为材料,采用ELISA和Real-time PCR技术研究了芜菁花叶病毒(TuMV)侵染后不结球白菜内源生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的动态变化以及内源激素相关基因的表达差异。结果表明:TuMV侵染后,植株发病症状的严重程度与IAA含量呈正相关;光敏色素相关蛋白基因PAP1对IAA的合成起负调控作用。处理植株体内GA3含量及其代谢相关基因,即原表皮因子基因PDF1表达量均明显低于对照植株,而ABA含量则随着接种时间的延长不断积累,始终高于对照植株。且发病症状越严重的植株中,GA3含量越低,ABA含量越高。处理植株JA含量和JA诱导基因,即营养贮藏蛋白基因Vsp1表达量在接种后均出现2次上升,且植株病症越严重,JA含量越低。TuMV侵染后,植株中IAA/ABA和GA3/ABA的值则明显低于对照植株,表明TuMV的侵染破坏了内源激素的平衡,干扰了植物的正常生长发育。