一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C.将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1.将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度.Western blot 分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应.对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值.     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与检测

目的 表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究.方法 根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增.把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定.将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体PGEX-6P-1,再将构建成功的原核表达质粒载体PGEX-6P-VP2转化至大肠杆菌BL21中,进行鉴定、测序、表达.结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与6个VP2基因序列的同源性为98.7%-99.7%.Western-blotting分析显示,表达产物约为90kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性.     

水稻草状矮缩病毒P2基因多克隆抗体的制备及应用

为了进行水稻草状矮缩病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)诊断方法和蛋白功能研究。通过RT-PCR方法从感染RGSV的水稻中克隆该病毒的P2基因,并将此基因片段重组到原核表达载体pDEST17上。将重组载体转化E. coli Rosetta,经IPTG诱导后获得分子量约为29 kDa含HIS标签的融合蛋白。以诱导的融合蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到l:8192。并用制备的抗体建立了特异、灵敏的检测RGSV的IC-RT-PCR和Dot-blot ELISA方法,为该病毒的检测、诊断提供了保障,同时也为P2蛋白的结构和功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.     

H5N1亚型禽流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因的进化及原核表达

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究

为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定嵌合蛋白的表达,通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力,通过动物试验研究其免疫原性。结果显示,嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,可自聚形成病毒样颗粒,免疫小鼠后可以产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。该研究为嵌合VP60 VLPs的形成及结构功能的研究奠定基础,同时为RHDV-VLPs作为外源B细胞表位展示载体的可行性提供依据。     

兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。     

锦鲤疱疹病毒ORFl基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus Virus,KHV）诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORFl基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌E．coliBL21（DE3）后诱导表达,再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS．PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37．3KD,为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1：27000。表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

锦鲤疱疹病毒ORF1基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后诱导表达。再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774 bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3 KD为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000,表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆与表达

猪圆环病毒II型(PCV2)是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原。本研究用PCR方法扩增PCV2截短的ORF2基因并亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,构建的重组表达质粒命名为pGEX-ORF2,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃经IPTG诱导4小时。PCV2的cap蛋白以包涵体形式得到有效表达。经SDS-PAGE及Western blot分析表明表达的重组蛋白分子量约为46KD,重组蛋白具有良好的免疫学活性。     

水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用

将水貂阿留申病毒ADV-G株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,鉴定后得到重组质粒pET-VP2a和pET-VP2b,将重组质粒转化到宿主菌BL21中,用IPTG分别以不同浓度,不同诱导时间进行诱导表达,采集样品做SDS-PAGE、Western-blot分析,并以此蛋白作为包被抗原进行ELISA检测。结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,4小时后表达可达到高峰,其大小分别约为23kD和28kD, 该蛋白与ADV阳性血清能发生特异性反应。将此表达产物应用Ni-NTA His-Bind纯化系统进行纯化,其纯度可达到91%,纯化后的蛋白以60μg/孔包被96孔板,检测不同地区水貂血清,同时以对流免疫电泳法（CIEP）为对照,结果发现二者的符合率高达93 %,而应用该蛋白进行检测其反应更为安全,背景低,制备简单,这为今后应用该蛋白作诊断抗原检测水貂阿留申病奠定了基础。     

籽粒苋C_4关键酶丙酮酸磷酸双激酶基因的原核表达及酶活性测定

为了进一步探究籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶(AhPPDK)蛋白的作用机制,构建了AhPPDK基因的原核表达载体,通过碱裂解提取质粒,经限制性内切酶酶切,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,选择正确表达的阳性重组子,将测序正确的重组质粒p EASY-E1-AhPPDK转化菌株Transetta(DE3);利用IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组AhPPDK能在大肠杆菌Transset(DE3)中高效表达,表达的重组蛋白质分子量约为108 k Da,与预期分子量相符,且为可溶性蛋白。利用紫外分光光度法测量结果表明,原核表达的AhPPDK具有酶活性,且上清粗酶液活性高于沉淀粗酶液。研究结果可为进一步探明AhPPDK蛋白的作用机制和转基因利用奠定基础。     

TAT-NPY融合蛋白的表达和生物活性检测

摘 要：为了研究含有跨膜结构域TAT基因的重组奶牛神经肽Y融合蛋白的生物学活性。利用基因工程技术,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行表达,对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化。并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成的促进作用,表明含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为动物试验奠定了基础。为了获得重组TAT-NPY融合蛋白,并研究其生物学活性。利用基因工程技术,从犊牛下丘脑组织中克隆得到神经肽Y基因序列,通过基因比对符合率为100%。同时,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行原核表达,并对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化。并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成起促进作用。表明含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为下一步的研究提供了物质基础。