Real-time PCR方法检测高脂饲喂小鼠肝脏CYP2A5的表达

为了建立非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型小鼠肝组织中CYP2A5表达的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法。高脂饮食诱导小鼠至8周,采用qRT-PCR方法检测小鼠肝脏中CYP2A5的表达水平,同时评价该方法的特异性。建立了小鼠肝组织中CYP2A5的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,结果显示,该方法的溶解曲线为单峰,同时核酸电泳显示一条特异性条带。检测结果表明,高脂诱导的NAFLD小鼠肝组织中CYP2A5的表达水平极明显高于正常对照组(P0.01)。表明该实时荧光定量PCR方法,特异性好、灵敏度强,为进一步研究小鼠CYP2A5的表达提供了试验基础。     

小鼠Sirt2基因的组织表达谱及其成肌细胞分化过程中的时序表达

本实验目的在于检测Sirt2在小鼠各组织器官及成肌分化过程中的表达情况,通过实时定量PCR及Westernblot检测Sirt2在小鼠各组织中的表达,发现Sirt2表达具有广泛性,其中在肌肉与心脏中高表达。进一步检测Sirt2基因在成肌细胞C2C12不同分化时间点的mRNA及蛋白表达情况,结果显示Sirt2在C2C12分化早期高表达,在分化晚期表达降低。Sirt2在成肌细胞分化过程中的差异表达显示,其可能在肌肉发育过程中发挥作用。     

肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

目的为研究抑癌基因Pten在肝脏中的生物学功能,利用Cre/Loxp基因敲除技术建立肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型。方法将Ptenflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配,对F1代小鼠进行鉴定,筛选出基因型为Ptenflox/+/Alb-Cre的子代小鼠,将其与Ptenflox/flox小鼠进行交配,筛选出基因型为Ptenflox/flox/Alb-Cre的F2代小鼠,将Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠与Ptenflox/flox小鼠进行交配,获得F3代基因敲除小鼠,Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠为本实验所构建的肝脏特异性Pten基因敲除小鼠,Ptenflox/flox小鼠为对照小鼠。提取小鼠基因组DNA,通过PCR方法鉴定不同子代小鼠的基因型;提取小鼠肝脏、肺以及肾脏组织的总RNA和蛋白,利用Real-TimePCR和WesternBlot技术检测Pten基因在小鼠不同脏器中的mRNA和蛋白质表达水平。结果获得敲除小鼠基因型为Ptenflox/flox/Alb-Cre,和对照小鼠相比,Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠在肺和肾脏中Pten基因的mRNA水平及蛋白水平无明显变化,仅在肝脏中Pten水平显著低于Ptenflox/flox型小鼠。结论本研究利用Cre/Loxp技术成功构建了肝脏特异性Pten基因敲除小鼠,为在体内进一步研究Pten基因的功能提供了重要动物模型。     

小鼠棕色脂肪转基因过表达miR-155损坏棕色脂肪细胞的分化

为探究microRNA-155(miR-155)对小鼠棕色脂肪组织分化的影响,收集广泛过表达miR-155的转基因小鼠(RL-m155小鼠)棕色脂肪组织,离体棕色脂肪大体拍照,然后收集部分组织固定、石蜡包埋和切片,并行HE染色,观察棕色脂肪细胞的大小和形态;同时RT-qPCR检测棕色脂肪组织中分化相关基因的表达水平。结果表明,RL-m155小鼠的体重、体型与对照小鼠无显著差异;与对照小鼠相比,RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155表达水平显著升高,而棕色脂肪组织体积及棕色脂肪细胞的大小均显著减小;棕色脂肪中特异表达基因(UCP1和SCA-1)、棕色脂肪分化调控因子(BMP2、BMP6、Smad1、Smad5、C/EBPB、MYO10和PTEN)、棕色脂肪分化诱导因子(PPARγ、PGC-1α、BMP2、BMP4、BMP7、BMPR1A和Sirt1)等棕色脂肪分化相关功能基因的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。表明RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155过表达,导致棕色脂肪组织分化受损。     

海南黑山羊CAST基因的时空表达分析

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术检测了CAST基因在1、2、3、4月龄和12月龄海南黑山羊骨骼肌、心肌、肝脏和脂肪组织中mRNA表达差异和发育规律,为揭示CAST基因的生物学功能及其对肉质的表达调控机理提供参考依据.结果表明,CAST基因在未成年羊的骨骼肌中mRNA表达量极显著高于其他组织（P＜0.01）,且在2月龄时达到最高水平;成年后在心肌、肝脏和脂肪中的表达量极显著升高（P＜0.01）,在骨骼肌中的表达量次之,但在脂肪中的表达量始终相对较低;该基因在3、4月龄各组织中的mRNA表达量相对较低,且四种组织在3、4月龄间表达差异不显著（P＞0.05）.     

SREBP-1基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达研究

研究旨在比较分析固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1)基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达规律,以探讨SREBP-1基因与肉牛脂肪代谢的关系。选取湖南德农牧业集团有限公司国家级保种场不同月龄(6月龄、18月龄、30月龄)湘西黄牛各4头,利用实时荧光定量PCR检测肝脏、背最长肌、皮下和腹腔脂肪组织SREBP-1基因的相对表达量。结果表明:①SREBP-1基因在湘西黄牛肝脏、背最长肌、皮下和腹腔脂肪的4个部位中的表达量随月龄增加依次显著增加(P0.01);②在6月龄时,皮下脂肪SREBP-1基因的表达量显著高于肝脏与腹腔脂肪(P0.05);③18月龄时,SREBP-1基因在肝脏中的表达量显著高于背最长肌与腹腔脂肪(P0.05);④30月龄时,SREBP-1基因在肝脏组织中的表达量显著高于其他3个组织(P0.05),在皮下脂肪中的表达量显著高于背最长肌与腹腔脂肪(P0.05)。由此可见,SREBP-1基因在湘西黄牛不同部位脂肪组织和肌肉组织中均有表达,且其表达随月龄与部位的不同而不同,存在月龄和部位的差异性。     

FNDC5在小鼠老龄化过程脂肪组织中的表达变化

本研究旨在探讨Ⅲ型纤连蛋白域包含蛋白5（type Ⅲ fibronectin domain contains protein 5,FNDC5）在小鼠老龄化过程中脂肪组织中的表达变化,以小鼠老龄化过程中不同发育阶段的健康小鼠为研究对象,通过HE染色、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blotting等技术研究小鼠老龄化过程中脂肪组织FNDC5的表达以及定位。结果发现,FNDC5在小鼠老龄化过程中各个发育时期的脂肪中均有不同程度的表达并呈现明显的差异性。HE染色发现,随着年龄的增长,脂肪细胞的大小呈现先逐渐增大后萎缩的趋势。免疫组织化学染色发现,FNDC5在幼年小鼠的脂肪组织中表达水平最高,在性成熟的脂肪组织中表达水平次之,老年的脂肪组织中的表达水平低于性成熟时期,体成熟的脂肪组织中表达水平最低。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果也与免疫组织化学染色趋势相符。以上结果表明,FNDC5基因可能在脂肪组织中发挥一定的作用,为研究脂肪代谢以及肥胖相关的疾病提供新思路。     

贵州地方黄牛不同组织中PPARγ基因表达水平研究

试验旨在研究威宁牛、思南牛、关岭牛和黎平牛不同组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ）基因mRNA的表达差异。以这4个贵州地方品种黄牛为试验动物,提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌组织的总RNA,设计PPARγ基因的实时荧光定量引物,以牛GAPDH基因为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ基因在4个品种不同组织中mRNA的相对表达量。结果显示,PPARγ基因在4个品种黄牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌组织中均有表达,但在脂肪组织中的表达量高于其他组织,且差异极显著（P<0.01）,在脾脏和肺脏中也有较高表达,而在肾脏、肝脏、心脏和背最长肌中表达量较低;不同品种PPARγ基因的表达在部分组织中存在差异。研究表明,PPARγ基因在不同组织中的表达量存在差异,可能与其在不同组织中的功能有关,而品种对于PPARγ基因的表达影响不大。     

贵州地方黄牛不同组织中PPARγ基因表达水平研究

试验旨在研究威宁牛、思南牛、关岭牛和黎平牛不同组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ,PPARγ)基因mRNA的表达差异。以这4个贵州地方品种黄牛为试验动物,提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌组织的总RNA,设计PPARγ基因的实时荧光定量引物,以牛GAPDH基因为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ基因在4个品种不同组织中mRNA的相对表达量。结果显示,PPARγ基因在4个品种黄牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌组织中均有表达,但在脂肪组织中的表达量高于其他组织,且差异极显著(P0.01),在脾脏和肺脏中也有较高表达,而在肾脏、肝脏、心脏和背最长肌中表达量较低;不同品种PPARγ基因的表达在部分组织中存在差异。研究表明,PPARγ基因在不同组织中的表达量存在差异,可能与其在不同组织中的功能有关,而品种对于PPARγ基因的表达影响不大。     

利用生物信息方法寻找与绵羊脂代谢相关的候选基因

本实验旨在利用生物信息方法寻找与绵羊脂代谢相关的候选基因并通过实时荧光定量以及Western Blot方法进行验证。利用NCBI网站中的公共测序数据找到3个与脂代谢相关的测序数据,每个测序数据取前250个差异表达基因作为备选结果,然后将3组数据中共有的差异表达基因作为研究对象,实时荧光定量PCR检测此基因在不同绵羊个体脂肪组织中的表达差异以及在同一只绵羊不同组织中的表达趋势,并检测基因在脂肪细胞分化过程中的表达规律。结果显示:3组脂代谢相关的公共数据有1个共有基因,即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似物1(Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine Like 1, SPARCL1)。SPARCL1基因在绵羊脂肪组织中显著表达,在不同个体脂肪组织中的表达量存在显著差异,在绵羊脂肪细胞分化前后SPARCL1基因出现差异表达。综上,SPARCL1基因可能是参与绵羊脂肪代谢的重要基因,其具体功能及作用机制需要进一步探究。     

脂多糖对奶山羊肝脏脂代谢关键基因表达的影响

12只初产萨能奶山羊被随机分为对照组和脂多糖(LPS)组,每组6只.试验结束后,采集肝脏组织,利用荧光定量PCR的方法检测肝脏TLR4信号通路关键分子、脂肪合成和转运关键基因的表达.结果显示,LPS能上调TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB基因的表达,下调LXRα、CD36、VLDLR、APOB、ACC和SCD的表达,对LXRβ和PPAR的表达影响不大.结果表明,LPS诱导肝损伤的同时能下调肝脏脂代谢基因的表达,进而降低肝脏合成与转运脂肪的能力.     

FABP5和CRABP2基因在绵羊不同组织中的mRNA表达研究

FABP5和CRABP2同属于脂肪酸结合蛋白,在动物体内均受视黄酸调节,调控脂质氧化和能量利用。本研究利用实时定量荧光PCR技术,对山西肉用绵羊母本品系10月龄去势公羊的皮下脂肪、心脏、肾、肝、肺、肌肉6种组织中FABP5和CRABP2基因的mRNA表达进行检测,同时利用GEO DataSets数据比较2个基因在人和小鼠各组织的mRNA表达,以探讨FABP5和CRABP2的组织表达规律。结果表明:FABP5和CRABP2在人、小鼠和绵羊的脂肪、心脏、肾、肝、肺和肌肉组织中均有表达,且有组织表达差异和种属表达差异;在绵羊中,FABP5和CRABP2均在脂肪组织中的mRNA表达量最高,且与其他组织差异显著(P<0.05);FABP5和CRABP2mRNA均在肝脏中表达最低。本实验结果为进一步研究FABP5和CRABP2基因在绵羊中的功能奠定基础。     

基于CRISPR/Cas9敲除技术研究Gata4基因在雄性小鼠睾丸发育中的功能

旨在通过CRISPR/Cas9技术研究Gata4基因在雄性小鼠睾丸中的作用机制。试验以C57BL/6小鼠为模型,通过CRISPR/Cas9技术在雄性小鼠体内敲除Gata4基因,组织学观察睾丸形态学变化,ELISA法测定雄激素相关合成酶,实时定量PCR检测相关标记基因。利用CRISPR/Cas9技术成功在小鼠体内敲除Gata4基因,通过PCR扩增、酶切计算得到基因敲除率93%;在2月龄小鼠性成熟时,通过定量PCR、HE染色和ELISA检测发现,与对照组相比,敲除组小鼠睾丸发育迟缓,明显变小,精原细胞和精子生成减少,睾丸中雄性信号通路相关基因(Stra8,Vasa,Dazl,Tnp1,Spo11,Sox9,17HSDb3,Dmrt1)表达量降低,雄激素水平显著降低。研究表明,Gata4在雄性小鼠生殖器官发育与精子生成过程中具有重要功能。     

PCK1基因在延黄牛不同部位脂肪组织和内脏中的表达分析

试验旨在阐明延黄牛PCK1基因在不同脂肪组织与内脏器官的表达水平,探讨PCK1基因表达与脂肪沉积的关系。以延黄牛皮下脂肪和背最长肌及其他内脏器官为材料,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法,对PCK1mRNA和蛋白质水平在延黄牛脂肪组织和内脏器官中的分布规律进行分析。实时荧光定量PCR结果表明,PCK1基因在肾脏、皮下脂肪和腹部脂肪中的表达量均显著高于背最长肌和其他内脏器官(P0.05),在肾脏中的表达量显著高于皮下脂肪和腹部脂肪(P0.05),在腹部脂肪中的表达量显著高于皮下脂肪(P0.05);而在背最长肌、肺、心脏、小肠和肝脏中表达差异不显著。Western blot结果表明,在腹部脂肪中PCK1蛋白的表达量显著高于皮下脂肪(P0.05)。研究结果可为进一步探讨脂肪沉积机制及优化延黄牛肉品品质奠定基础。     

fat-1转基因小鼠脂类代谢相关基因的表达分析

为了分析fat-1转基因小鼠对3个脂类代谢关键基因(FASN、PPAR、LPL)的组织表达特性,研究利用实时荧光定量PCR技术检测FASN、PPAR和LPL在心脏、肝脏、骨骼肌组织中的表达情况。结果表明:FASN、PPAR、LPL基因在转基因小鼠心脏、肝脏、骨骼肌的表达情况有很大差异。其中PPAR和LPL基因在转基因小鼠肝脏组织中极显著升高(P0.01),而在心脏、骨骼肌的表达量显著或极显著下降(P0.01或P0.05);FASN基因只在骨骼肌中极显著下降(P0.01),而在心脏和肝脏中没有发生明显变化(P0.05)。说明fat-1基因能够在机体脂类代谢的调控过程中发挥重要的作用。     

绵羊CCCH型锌指蛋白基因ZC3H10的mRNA表达研究

为探明ZC3H10基因在绵羊组织及前体脂肪细胞分化过程中的mRNA表达规律,利用转录组测序技术分析ZC3H10在绵羊肾周脂肪、皮下脂肪和尾部脂肪组织的表达模式。利用实时荧光定量PCR技术检测ZC3H10在成体绵羊脂肪组织以及心脏、肾、肝、肺、脾、小肠和肌肉(背最长肌)8种不同器官组织的mRNA表达水平,测定其在体外前体脂肪细胞分化0、2、4、6、8、10d的表达变化。结果显示:ZC3H10在绵羊3个脂肪组织部位均有高水平的mRNA表达,且与脂肪沉积相关基因FABP4和ADIPOQ有相似表达特征;ZC3H10在所检测的组织均有mRNA表达,其在前体脂肪细胞分化0 d的mRNA表达显著高于其他时间点,分化10 d的表达显著低于其他时间点。绵羊ZC3H10 mRNA高表达于脂肪组织,也表达于其他多种器官组织,且在前体脂肪细胞分化过程中呈表达下调趋势,可能在脂肪代谢和脂肪细胞分化中发挥重要作用。     

从江香猪和大白猪不同组织中GYS1、GYS2基因表达水平的研究

旨在研究糖原合成酶(GS)基因mRNA在从江香猪和大白猪表达情况,探究肌肉类型糖原合成酶(GYS1)和肝脏类型糖原合成酶(GYS2)基因表达规律。以大白猪和从江香猪为试验动物,分别提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大肠、小肠、背最长肌、脂肪10个组织的总RNA,设计各自实时荧光定量引物,以猪GAPDH基因作为内参基因,应用实时定量PCR技术检测GYS1和GYS2基因不同组织中mRNA的相对表达量。结果发现:GYS1基因在大白猪和从江香猪所检测的组织中均有表达,在背最长肌中的表达量最高,且在大白猪背最长肌中表达量显著高于从江香猪(P0.05);GYS2基因在肝脏中表达量最高,其他组织中几乎不表达,具有肝脏组织特异性,且发现在从江香猪肝脏中表达量显著低于大白猪(P0.05)。本研究为GYS1和GYS2基因后续真核表达的研究提供了理论依据。     

鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖诱导的小鼠急性炎症的影响

试验旨在探讨鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性炎症的影响。将24只SPF雌性小鼠随机分成4组:PBS组,LPS模型组,重组UBC13蛋白高、低剂量组(分别为100和25μg/只),每组6只。LPS模型组与各蛋白剂量组腹腔注射20 mg/kg LPS,PBS组腹腔注射等体积PBS;注射结束1 h后,各蛋白组按相应剂量背部皮下多点注射重组UBC13蛋白,PBS组与LPS模型组注射等体积PBS。给予蛋白24 h后处死小鼠。收集小鼠肺脏、脾脏、胸腺及肝脏组织,计算脏器指数,HE染色观察组织病理学变化,实时荧光定量PCR检测肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的相对表达量,以及肺脏中iNOS mRNA的相对表达量,综合评价鼠源重组UBC13蛋白对LPS诱导小鼠急性炎症的影响。结果显示,与PBS组相比,LPS模型组小鼠肺脏、脾脏及肝脏指数均显著或极显著升高(P0.05;P0.01),且肺脏、脾脏和肝脏组织均出现病理变化。实时荧光定量PCR结果显示,与PBS组相比,LPS模型组肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量均极显著升高(P0.01),肺脏中iNOS mRNA相对表达量也极显著升高(P0.01);与LPS模型组相比,UBC13蛋白高剂量组肺脏、脾脏和肝脏中病理变化明显改善,肺脏、肝脏、脾脏中IL-1β、TNF-α、IL-6及肺脏中iNOS mRNA表达量均极显著降低(P0.01);胸腺中TNF-αmRNA表达量显著降低(P0.05),IL-6 mRNA和IL-1β表达量极显著降低(P0.01)。表明鼠源重组UBC13蛋白可下调炎性因子的表达,从而改善LPS诱导的小鼠急性炎症反应。     

HSL和PPARγ基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达

比较分析HSL和PPARγ基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达规律,以探讨HSL和PPARγ基因与湘西黄牛脂肪酸代谢的关系。利用实时荧光定量PCR技术检测HSL和PPARγ基因在6,18,30月龄湘西黄牛的肝脏、肌肉组织(背最长肌)、脂肪组织(皮下脂肪和腹腔脂肪)中mRNA的相对表达量。结果表明:HSL基因在湘西黄牛肝脏、背最长肌、皮下脂肪和腹腔脂肪的4个部位中的表达量随月龄增长依次极显著减少(P0.01),而PPARγ基因正好相反。6月龄时,肝脏中HSL基因的表达量显著高于其他3个组织(P0.05),PPARγ基因皮下脂肪表达量显著高于肝脏(P0.05); 18月龄时,HSL基因在4个组织中的表达量按大小关系依次为肝脏≈背最长肌皮下脂肪腹腔脂肪; PPARγ基因在4个组织中的表达量按大小关系依次为皮下脂肪肝脏≈腹腔脂肪背最长肌; 30月龄时,HSL基因在4个组织中的表达量按大小关系依次为肝脏背最长肌皮下脂肪≈腹腔脂肪; PPARγ基因在4个组织间的表达呈现两两差异显著(P0.05),其表达量依次为肝脏皮下脂肪腹腔脂肪背最长肌。30月龄的粗脂肪(EE)含量和饱和脂肪酸(SFA)含量显著高于6月龄和18月龄的(P0.05),18月龄和30月龄湘西黄牛肉多不饱和脂肪酸(PUFA)含量显著高于6月龄的(P0.05); 30月龄时单不饱和脂肪酸(MUFA)的含量较高,但显著低于18月龄的(P0.05)。由此可见,HSL和PPARγ基因在湘西黄牛不同部位脂肪组织和肌肉组织中均有表达且随月龄与部位的不同表达不同,存在月龄和组织差异性,且二者的表达规律呈负相关。在动物生产应用中,建议湘西黄牛在30月龄左右再屠宰食用,口感及营养价值更好。