转基因植物标记基因安全性研究进展

对目前提高转基因植物标记基因安全性的方法进行综述,包括共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组以及利用无选择标记基因的转化系统及安全标记基因的转化系统。介绍了上述各方法的原理、优缺点及其在转基因植物中的研究进展,并对其未来的发展趋势进行了展望。     

转基因植物中删除选择标记基因的研究进展

选择标记基因广泛应用于植物转基因工程中,然而这些基于除草剂和抗生素类抗性选择标记基因的利用,在转基因筛选和鉴定完成后功能多余。当前转基因植物的标记基因及相关产物对环境污染和食用安全的潜在影响,已经引起了人们的广泛关注。随着转基因技术的不断发展和人们对转基因植物和食品安全性的关注,删除转基因植物中的选择标记基因非常重要。文章着重讨论了植物转基因过程中,选择标记基因的利用,删除选择标记基因的几种方法,包括共转化法、位点特异性重组、染色体内重组、转座子介导的重组、删除叶绿体转化中选择标记基因,以及无选择标记基因植株的直接再生等。同时,还对这些技术的发展作了展望。     

无选择标记的转基因家畜制备技术

选择标记基因(Selectable marker genes,SMGs)为目前应用体细胞核移植技术制备转基因家畜所必须.然而一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后,SMGs就变成不需要的或多余的,而且这些带有标记基因的家畜还存在安全方面的隐患.因此,建立无选择标记的转基因家畜技术势在必行.目前能够采取的策略一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的家畜之后,删除SMGs;二是使用无筛选标记的转基因技术.综述了应用Cre/LoxP位点特异性重组系统删除SMGs的各种方法,以及应用锌指核酸酶(ZFNs)、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术,基于受精卵显微注射的无筛选标记转基因技术的研究进展,分析对于制备无SMGs的转基因家畜而言后者的优势所在,旨在为转基因家畜研究提供参考.     

利用CRISPR/Cas9技术敲除转基因水稻中的潮霉素标记基因

【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统及其在作物育种中的应用

基因编辑是一项对目的基因进行修饰的新技术,由成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR associated,Cas)组成的系统(CRISPR/Cas)为新一代基因编辑技术,其中Cas9蛋白与CRSPR结合形成的编辑系统CRISPR/Cas9因其简单易操作的特性已广泛应用于植物基因组编辑,发展潜力巨大.文章论述了CRISPR/Cas9系统的作用原理、发展历程及在植物基因组中的定点编辑效应,并分析CRISPR/Cas9在水稻、小麦、玉米等作物育种中的应用现状,发现其在改良水稻产量和质量相关性状、小麦白粉病抗性及玉米乙烯敏感等性状上效果明显.在今后的研究中,应针对不同作物的育种目标,深入了解目标基因的功能作用来设计相应的操作方案,并提高该系统对作物目的基因改良的效率,加强其安全性等,以促进基因编辑在作物育种中的应用,加快育种进程.     

用共转化法培育无选择标记转基因植物研究进展

介绍了用农杆菌介导的共转化法培育无选择标记基因转基因植物的原理、方法、影响因素以及其国内外研究进展.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用与政策监管

基因编辑技术是一种在基因组水平上对DNA序列进行精准修饰,从而促使基因组序列定向改造的技术。随着近几年CRISPR/Cas9技术的快速发展,基因组编辑技术在作物育种领域发挥了越来越重要的作用。本文综述了基因编辑技术的发展历程,以及CRISPR/Cas9的工作原理,分析了CRISPR/Cas9的局限性并提出了改进方法。重点阐述了植物CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立、在植物性状改良方面的应用,以及最终致力于基因编辑产品商业化的应用案例。同时还分析了美国、欧盟、英国、日本和中国这5个代表性国家/地区的基因编辑监管政策和态度,以期为我国科学监管框架的建立提供参考,促进CRISPR/Cas9在我国乃至全球的产业化应用。     

利用PEI-SWNT介导的瞬时转化检测青花菜基因编辑效率

CRISPR/Cas9基因编辑系统是作物分子设计育种的重要手段,sgRNA设计对于提高基因编辑效率具有重要作用.为了提高sgRNA设计的准确度,构建了聚乙烯亚胺修饰的单壁碳纳米管(PEI-SWNT)介导的瞬时转化体系,并用于检测青花菜CRISPR/Cas9基因编辑效率.结果表明,CRISPR/Cas9编辑体系可以诱导青花菜特定基因位点发生突变,编辑效率为8.3％.研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制青花菜新种质提供了基础.     

基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的水稻定向改良研究进展

水稻（Oryza sativa L.）是单子叶植物研究的模式作物,同时也是世界上最重要的粮食作物之一。我国是世界上最大的稻米生产国和消费国,水稻在保障粮食安全方面发挥着极其重要的作用。水稻品种的不断改良升级是保障稻米稳产增产的有效途径。以育种家经验为基础的传统育种方式的育种周期长、精准性差、可预见性低,已逐渐不能满足现代育种需求。CRISPR/Cas9 是继锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）等技术之后的新一代基因编辑技术,能在不改变受体遗传背景的前提下,精准、定向地改造控制重要性状的功能基因以达到性状快速升级改良的目的,已逐步成为动植物科学研究和作物育种的重要工具。目前CRISPR/Cas9 基因编辑技术已经广泛应用于水稻重要性状的定向改良和种质资源创新研究。综述了 CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理及其在水稻抗病性、品质、育性、非生物胁迫等方面的研究进展,并对 CRISPR/Cas9技术的发展和未来在水稻育种中的应用进行了展望,为未来 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在作物定向改良中的进一步利用提供参考。     

CRISPR/Cas9技术及其在水稻和小麦遗传改良中的应用综述

CRISPR/Cas9技术是新发展的定向基因编辑技术,CRISPR/Cas9技术是在细菌和古细菌中发现的1种抵御外来病毒及质粒入侵的获得性免疫系统。CRISPR/Cas9技术由sgRNA(单向导RNA)介导,与Cas9核酸酶切割实现作物定点编辑改良。本文主要对CRISPR/Cas9技术的工作原理、系统分类、结构、系统构建方法进行了系统介绍。同时,总结了CRISPR/Cas9技术在水稻和小麦的突变体库的建立和基因功能研究、品质和农艺性状遗传改良等方面的研究。并对CRISPR/Cas9技术对作物进行定向编辑改良进行了展望,以期为利用CRISPR/Cas9技术创制新品种、作物品种改良提供参考。     

无选择标记的植物转基因方法研究技术进展

植物遗传转化中,标记基因起着非常重要的作用。目前使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因,其引发的转基因植物安全性问题越来越受重视。笔者综述了近年来发展的各种无选择标记转基因植物方法及其在转基因植物中的应用,主要有共转化法、位点特异性重组系统、转座子系统、同源重组法和多元自主转化载体系统。通过评述各种方法的优缺点,以期推动安全型转基因植物培育和转基因植物产业化进程。     

限控基因飘流的生物学措施研究进展

转基因作物种植面积逐年增加,到2011年全球转基因作物的种植面积达到1.6亿hm2,较1996年增长了近94倍。随着转基因作物的大面积商业化种植,由此带来的生物安全问题越来越受到人们的关注,其中花粉介导的基因飘流是人们关注的焦点问题之一。探索限控转基因飘流的生物学措施是当前国际上关于生物安全研究的热点和焦点。因此,就目前研究较多的生物学措施如叶绿体转化技术、基因剔除技术、转基因弱化技术、雄性不育技术、种子不育技术、闭花受精和无融合生殖技术、基因拆分技术、可控转基因技术等进行了综述,并对将来的研究方向进行了展望。     

Genetic and agronomic traits stability of marker-free transgenic wheat plants generated from Agrobacterium-mediated co-transformation in T_2 and T_3 generations

Genetically modified wheat has not been commercially utilized in agriculture largely due to regulatory hurdles associated with traditional transformation methods. Development of marker-free transgenic wheat plants will help to facilitate biosafety evaluation and the eventual environmental release of transgenic wheat varieties. In this study, the marker-free transgenic wheat plants previously obtained by Agrobacterium-mediated co-transformation of double T-DNAs vector were identified by fluorescence in situ hybridization(FISH) in the T_1 generation, and their genetic stability and agronomic traits were analyzed in T_2 and T_3 generations. FISH analysis indicated that the transgene often integrated into a position at the distal region of wheat chromosomes. Furthermore, we show that the GUS transgene was stably inherited in the marker-free transgenic plants in T_1 to T_3 generations. No significant differences in agronomic traits or grain characteristics were observed in T_3 generation, with the exception of a small variation in spike length and grains per spike in a few lines. The selection marker of bar gene was not found in the transgenic plants through T_1 to T_3 generations. The results from this investigation lay a solid foundation for the potential application of the marker-free transgenic wheat plants achieved through the co-transformation of double T-DNAs vector by Agrobacterium in agriculture after biosafty evaluation.     

Cre／loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

位点特异性重组系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入或删除,已成为植物遗传操作中的重要工具。本文简要介绍目前应用最为广泛的Cre/loxp位点特异性重组系统的重组机制,并着重阐述Cre/loxp系统在删除转基因植物中标记基因及定点整合等方面的应用。     

可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展及其在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行定向编辑，在植物基因功能研究和遗传改良中具有巨大的潜在应用价值，因其具有高效、操作便捷及成本低的特点，成为当前基因组编辑技术的主流。概述了CRISPR/Cas9系统的起源、分类、作用机制及其在农作物和林木基因功能验证和遗传改良中的应用，并对未来需要完善的相关问题和发展趋势进行了探讨。     

农杆菌介导的作物遗传转化研究进展

分子生物学与植物基因工程的迅速发展,使得通过基因工程手段改良作物品质、改善作物耐胁迫能力、提高作物产量成为培育作物新品种的一种有效手段.为此,综述了农杆菌介导遗传转化的分子机制、标记基因的应用、作物转化研究进展和转基因应用前景.     

CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用

CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术。总结了CRISPR/ Cas9基因组定向编辑技术的发展历程,并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。CRISPR/Cas系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来质体或者噬菌体。 根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同,已发现的CRISPR/Cas系统可以分为3种不同类型,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅱ型是以Cas9蛋白及导向RNA为核心组份,组成较为简单,是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自CRISPR/Cas9技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后,经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中。CRISPR/Cas9与ZFNs或TALENs一样都是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂,然后通过非同源末端连接或同源重组介导的修复2种方式引入突变。至今,在多种作物中已实现诱导产生多种定点突变（包括插入、缺失或修饰等）,并可获得较高的突变诱导率和可稳定遗传的基因组编辑后代植株。与ZFNs或TALENs技术相比,CRISPR/Cas9技术可以实现对基因组中多个靶基因同时进行编辑,从而可以用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因,为其一大优势。由于CRISPR/Cas9技术具有突变诱导率高、成本低、易于操作及可以多重基因编辑等特点,已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。CRISPR技术除了可以对基因组中不同靶基因进行定向编辑以外,还可以广泛地应用于基因表达调控研究、细胞定位运输系统研究及新型RNA沉默系统构建等方面。基因组编辑技术是继转基因技术之后人类对生物进行遗传操作的又一个革命性技术。但是,与转基因技术相比,CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作更加简单、快捷。应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行育种可以不引入外源基因,在进行基因组编辑之后可以不留下转基因的痕迹,从而导致定义转基因生物的不明确性,因此,政府监管部门是否应该按照转基因的管理办法来监管CRISPR/Cas9技术的应用尚有待决定。