RT－PCR方法检测番茄环斑病毒的研究

 根据番茄环斑病毒（TomRSV）外壳蛋白基因序列设计的引物P1,P2,用感病及健康组织总RNA为模板,进行RT-PCR试验,结果从感病组织中扩增出了470 bp的目的片段,而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件,建立了RT-PCR检测番茄环斑病毒（TomRSV）的方法。     

RT－PCR方法检测番茄环斑病毒的研究

根据番茄环斑病毒（TomRSV）外壳蛋白基因序列设计的引物P1，P2，用感病及健康组织总RNA为模板，进行RT-PCR试验，结果从感病组织中扩增出了470bp的目的片段，而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件，建立了RT-PCR检测番茄环斑病毒（TomRSV）的方法。     

应用分子生物学方法快速检测烟草环斑病毒

根据烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR扩增引物,对烟草环斑病毒和非烟草环斑病毒的感病植物组织样本进行了PCR扩增反应。结果,烟草环斑病毒的感病植物组织样本的PCR产物均出现1 760 bp的特异性扩增条带,而非感病植株组织样本均未出现扩增条带,证明该合成引物具有烟草环斑病毒鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果可检出烟草环斑病毒RNA模板最低浓度为234 pg/μl。研究表明,分子生物学测定具有特异性强、灵敏度高、快速准确的特点,可应用于烟草环斑病毒检疫的快速检测。     

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。     

花卉病毒病害的鉴定-(Ⅱ)

 本文对7种花卉病毒进行了寄主范围,症状反应、蚜虫传播、血清学、交互保护反应等试验以及电镜观察,结果表明,引起秋海棠叶片退绿环斑及坏死环斑、绣球暗绿花叶、绣球叶片皱缩及叶片簇生、凤仙花系统退绿及矮化、唐菖蒲条纹花叶、百合严重失绿及顶尖坏死、月季叶片扭曲皱缩及脉失绿、月季叶片呈现蚀纹及波纹状黄色花叶和虞美人叶片失绿及幼苗萎蔫的毒原依次为李坏死环斑病毒、烟草环斑病毒(TRSV)、绣球环斑病毒、TRSV、黄瓜花叶病毒、TRSV、南芥菜花叶病毒、苹果花叶病毒以及TRSV。     

广西烟草病毒病发生相关因素分析及综合防治研究

调查研究发现,广西烟草病毒病有烟草花叶病毒病（TMV）、黄瓜花叶病毒病（CMV）、马铃薯Y病毒病（PVY）、烟草蚀纹病毒病（TEV）、烟草环斑病毒病（TRSV）和由番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）引起的曲叶病毒病等6种,其中TMV分布最广、危害最大;烟草病毒病的发生与主栽品种抗病性、虫媒、气候、种植区域调整及农事操作等因素有关。2005～2007年连续3年在广西靖西县开展烟草病毒病综合防治试验示范,综合防治效果分别为90．38％、89．51％和82．35％,示范区烟草病毒病发病率和病情指数明显降低,上等烟比率、单产、产值等均比对照区高,示范区烟草病毒病综合防治取得了显著效果。     

RT－PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒(Ｐｒｕｎｕｓｎｅｃｒｏｔｉｃｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ,ＰＮＲＳＶ) ,根据该病毒ＲＮＡ 3序列设计引物 ,对感病和健康组织总ＲＮＡ进行ＲＴ—ＰＣＲ ,结果从感病组织中扩增出了大约 450ｂｐ的目的版段 ,而健康组织中无此扩增带。将此ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ -Ｔ -ｅａｓｙ载体 ,转化大肠杆菌ＤＨ5α菌株 ,得到了含有目的片段的重组子 ,并采用双脱氧终止法进行序列分析 ,结果与美国报道的李坏死环斑病毒 (ＰＮＲＳＶ)ＲＮＡ 3序列对应部分核苷酸基本一致 (其同源性达93 6%) ,这表明应用ＲＴ -…     

Monoclonai antibody preparation of Tobacco ringspot virus based on antigenic epitopes

基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白抗原表位所在的结构域,明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸残基附近.通过RT-PCR扩增出了目的片段,构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体,表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性.采用杂交瘤细胞技术,利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体,制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应.检验结果表明,制备的抗血清具较好的特异性,可应用于TRSV的检疫检验.     

基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备

基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白抗原表位所在的结构域,明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸残基附近。通过RT-PCR扩增出了目的片段,构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体,表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性。采用杂交瘤细胞技术,利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体,制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应。检验结果表明,制备的抗血清具较好的特异性,可应用于TRSV的检疫检验。     

烟草环斑病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法研究

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。     

一步法RT-PCR检测烟草环斑病毒试剂盒的研制与应用

根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明,该试剂盒在常温、4℃和-20℃下可分别保存2d、7d和60d;灵敏度是DAS-ELISA的100倍;质量控制试验结果一致,具有较高的重复性。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅻ病原研究：病毒问题

 云南烟草丛枝症病害病程表现为潜伏、过敏反应、缩顶、丛枝等4个阶段,以过敏反应导致叶片严重坏死和枯死为前期特征,以腋芽丛生而表现为黄化丛枝症为后期特征,苗期感染形成僵苗症,大田期感染表现丛枝症;汁液摩擦接种11科32种植物发现其只侵染烟属植物,通过机械传染(嫁接、汁液) 和介体传染(菟丝子、蚜虫、烟盲蝽、叶蝉) 等方式传播,该病害与文献记载的烟草丛枝、丛顶和丛蔟类病害有明显区别,可能是未见记载的病害。在云南烟草丛枝症病株的老叶和带毒蚜虫中抽提到直径约22～24nm的球状病毒,回接烟草发病,病株检测到和云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA,说明该病毒和云南烟草丛枝症病害有密切的关系,且与SBMV,VTMV,TRSV,ArMV,CarMV,CMV,BCMV,TNV等8种病毒无血清学关系,综合各项研究和文献检索结果,作者推测该病毒可能是未见记载的病毒,建议称为"烟草簇矮病毒(Tobaco bushy dwarf virus)"。     

花卉病毒病害的鉴定——(Ⅰ)

 1986年开始糸统普查花卉病毒病,对其中9种花卉毒原进行了寄主范围、症状反应、蚜虫传播、种子传播、血清学及电镜观察等试验。结果表明:忽地笑黄色条纹花叶病、鸢尾条纹花叶病、金盏花花叶及皱缩病、观赏木本番茄轻花叶病、虾衣花花叶病、菊花皱缩茎枯病、菊花花叶病、雏菊花叶病、秋葵轻花叶病的毒原依次为水仙黄条病毒、鸢尾花叶病毒、烟草环斑病毒、烟草花叶病毒、烟草环斑病毒、番茄斑萎病毒、烟草环斑病毒、黄瓜花叶病毒和秋葵花叶病毒。