伏马毒素B_1对猪肾上皮细胞增殖的影响

研究旨在探究伏马毒素B_1(FB_1)对猪肾上皮细胞增殖的影响,通过MTT检测FB1对PK15细胞活力和qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平。结果表明,FB1显著减少细胞活力,降低细胞核增殖抗原PCNA和周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表达水平,升高P21和P27的mRNA表达水平。说明FB1可通过调控细胞周期相关基因的表达抑制猪肾上皮细胞增殖。     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

梅花鹿鹿茸S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化

我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。为了解决这一问题,我们针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoR I和BamH I酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的片段。其后将S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体酶切并进行了连接,转入Top10F’感受态细胞中,涂板筛选出了阳性克隆,进行了菌液PCR及双酶切鉴定,再将重组质粒转入了BL21（DE3）pLys S表达菌株进行了IPTG诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot鉴定表明融合蛋白成功表达,随后对融合蛋白进行了纯化。本研究成功地实现了鹿本身特有的S100A4基因的体外表达。     

利用慢病毒表达载体干扰梅花鹿角柄骨膜细胞P21基因

利用慢病毒干扰系统,对东北梅花鹿角柄骨膜干细胞(PP细胞)P21基因进行干扰。结果表明:筛选出的2条针对梅花鹿P21基因的siRNA与载体质粒PLVTHM连接成功,并与pMD2.G、pCMV-dr8.9质粒共转染到293t细胞,获得重组慢病毒;通过感染PP细胞并利用流式细胞仪进行分选,获得了纯度90%以上的感染细胞;荧光定量RT-PCR检测表明P21基因的mRNA水平大幅度下调,干扰效率达到70%。表明成功干扰了P21基因在PP细胞中的表达,获得了低表达P21的PP细胞系。     

发酵乳杆菌对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤干预作用的研究

旨在研究发酵乳杆菌能否通过抑制NF-kB信号通路的激活,调控下游炎性细胞因子,进而对脂磷壁酸(LTA)所诱导的牛子宫内膜细胞(BEND)炎性损伤发挥保护作用,并通过体外试验对其作用机制进一步研究,为解决牛子宫内膜炎的治疗难题提供方向。以牛子宫内膜细胞为研究对象,LTA和发酵乳杆菌分别作为毒药与解药来建立体外细胞试验模型,测定细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌量和炎性相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65 mRNA的表达量。结果表明:LTA组、LTA+Lf组、Lf组炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达水平均高于对照组。LTA组与对照组比较差异极显著(p0.01);Lf组与对照组比较,TNF-α、IL-6细胞因子差异不显著(p0.05),IL-1β、IL-8细胞因子差异显著(p0.05);LTA+Lf组与LTA组比较,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达量显著降低(p0.05)。LTA组、LTA+Lf组、Lf组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量均高于对照组。LTA组与对照组相比,7种基因m RNA的表达量极显著增加(p0.01);Lf组与对照组相比,TNF-α、IL-6基因mRNA的表达量增加不显著(p0.05),IL-8基因mRNA的表达量增加显著(p0.05),IL-1β、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量极显著增加(p0.01);LTA+Lf组与LTA组相比,7种基因mRNA的表达量均极显著降低(p0.01)。发酵乳杆菌能够抑制NF-kB信号传导通路,调控炎性细胞因子的表达与释放,抑制炎性反应的发生,缓解LTA的细胞毒性,对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤起干预作用。     

干扰EZH2的表达对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响

[目的]本试验旨在探究EZH2对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响。[方法]通过siRNA干扰EZH2在奶山羊精原干细胞中的表达,验证干扰效率,并采用ELISA、qPCR和Western blot检测抗氧化酶活性和抗氧化相关基因与蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,干扰EZH2极显著提高奶山羊精原干细胞中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性(P0.01),而丙二醛(MDA)含量极显著下降(P0.01)。在分子水平上,干扰EZH2后,奶山羊精原干细胞中CAT、SOD2蛋白和mRNA表达水平均极显著提高(P0.01),GPx mRNA表达水平极显著上升(P0.01)。[结论]在体外培养的奶山羊精原干细胞中,干扰EZH2增强了细胞的抗氧化能力,其分子机制可能与激活CAT和SOD2蛋白并促进其下游抗氧化基因GPx表达相关。     

梅花鹿Thymosin beta 10基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

利用慢病毒干扰系统,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells,AP细胞)Thymosin beta 10(Tβ10)基因进行RNA干扰(RNA Interference,RNAi),并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表明:试验设计的3条针对梅花鹿Tβ10基因的shRNA序列与载体质粒p LVTHM连接成功,与p SPAX2、p MD2.G质粒共转染HEK 293T细胞,获得的重组慢病毒成功感染了AP细胞;荧光定量PCR检测结果表明,RNA干扰后Tβ10基因的mRNA水平下调,MTT试验结果显示Tβ10基因的下调可以抑制AP细胞增殖。试验成功构建了针对梅花鹿Tβ10基因RNAi载体,并成功干扰了Tβ10基因在AP细胞中的表达,基因下调最高可达35.6%,并初步确定Tβ10基因下调可抑制AP细胞的增殖。     

p53信号通路在MTB感染肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549中的免疫调控作用

【目的】探讨p53通路在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的免疫调控作用。【方法】将供试的p53基因过表达和干扰载体转染293T细胞,对其作用效果进行验证。利用脂质体分别转染p53基因过表达和干扰载体到AECⅡ细胞系A549中,建立p53基因过表达和干扰A549系模型细胞。用牛结核分枝杆菌减毒株(BCG)分别感染未经任何处理的A549细胞(感染对照组)及模型细胞,以未感染BCG的各类A549细胞为参照。以β-actin为内参基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析信号分子p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达,以及炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的mRNA表达情况。【结果】过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT和干扰载体TP53-RNAi(2648)作用效果明显,成功建立了p53基因过表达和干扰的A549细胞模型。BCG感染的对照组、p53基因过表达组和干扰组的A549细胞中,p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达显著或极显著高于相应的BCG未感染组,其中p300表达与p53基因表达量呈正相关,NF-κB、TLR-4、TRAF6表达与p53基因表达量呈负相关;BCG感染可引起TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的显著表达,且与p53基因表达量呈负相关。【结论】BCG感染A549细胞时,p53信号通路中的p53协同p300来抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化及负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,从而抵抗MTB的侵染。     

microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响

【目的】构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1基因(IGF1)的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响。【方法】根据IGF1mRNA序列设计并合成4对premicroRNA前体片段,定向克隆于pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-4;测序分析插入序列的完整性,将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1蛋白的表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响。【结果】测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确。转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1mRNA的表达水平均有所下降,其中转染重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,因而筛选重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2为最佳干扰质粒。与对照组相比,IGF1蛋白的表达水平降低;重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期。【结论】梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中,miRNA具有重要的调控作用。     

鹿生茸区骨膜不同部位生茸潜力的研究进展

鹿茸是雄鹿的第二性征,是由雄鹿头部额外脊处的骨膜组织所形成的,这部分骨膜被称为"生茸区骨膜"。生茸区骨膜具有巨大的生茸潜力,将生茸骨区膜移植到鹿体的其它部位,能诱导异位鹿茸的发生;一片直径约2cm的生茸区骨膜组能够在约60d的内再生出约10kg左右的鹿茸组织。研究发现,生茸区骨膜不同区域具有不同的生茸潜力,分别负责形成鹿茸的不同分枝和主干;生茸区骨膜细胞为干细胞。鹿茸干细胞的发现,为研究鹿茸生物学特性和揭示鹿茸完全再生机制开辟了一条新的通路。     

S100A4蛋白的生物学功能研究进展

S100A4是S100蛋白家族成员之一,是一种具有EF双螺旋结构域的Ca2+结合蛋白。S100A4在多数成体组织细胞中不表达,在多种肿瘤和干细胞等增殖细胞内高度表达。相关研究表明,S100A4蛋白的表达与细胞的异常增生及肿瘤的发生、发展有关,并可促进肿瘤细胞的转移、侵入以及瘤区血管的生成。本研究组发现,S100A4在鹿生茸区骨膜(鹿茸发生的组织基础)和角柄骨膜(鹿茸再生的组织基础)的组织细胞中均大量存在。与肿瘤细胞不同的是,鹿茸干细胞并没有因为S100A4的表达而发生异常的侵入和转移,其增殖、生长直至分化为形状规则的完整鹿茸受到了严格的调控。鹿茸是哺乳动物中唯一可以周期性再生的复杂器官,其再生的机制引起了越来越多的关注,S100A4作为一种在快速增殖细胞中高度表达的多功能蛋白,为我们揭示鹿茸的发生与再生机制提供了一个新的研究方向。     

家蚕细胞cyclinA基因的干涉对家蚕细胞增殖的影响

[目的]研究小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞cyclinA基因表达及细胞周期的影响.[方法]通过脂质体转染试剂将针对cyclinA基因的特异性siRNA片段转入家蚕BmN细胞,采用SYBR荧光定量PCR法检测cyclinA mRNA的表达,流式细胞技术检测细胞周期变化.[结果]转染siRNA-cyclinA可有效下调cyclinA基因的表达,转染48 h后,cyclinA mRNA表达量降低到对照的37.4％;流式细胞仪分析表明:与对照组相比,转染组Go/G1期细胞比例显著增加,细胞周期阻滞于G1期.[结论]靶向cyclinA基因的siRNA片段,通过下调cyclinA基因表达能有效抑制细胞增殖.     

p66Shc对绵羊早期胚胎发育的影响

[目的]探讨p66Shc对绵羊早期胚胎发育的影响.[方法]以受精后28 h为节点,将早期胚胎分为早卵裂胚胎和晚卵裂胚胎,观察不同时期卵裂胚胎的进一步发育情况,同时通过实时荧光定量PCR检测不同来源的4-8细胞阶段胚胎中p66Shc基因的表达水平;利用siRNA分子干扰技术将特异性siRNA分子通过显微注射到绵羊合子细胞质中,以敲减早期胚胎p66Shc基因;通过免疫荧光技术检测p66Shc基因对绵羊早期胚胎发育过程中活性氧(ROS)和氧化应激标记物(8-OHdG)表达的影响.[结果]早卵裂胚胎的囊胚发育率显著高于晚卵裂胚胎(P<0.05);晚卵裂胚胎中p66Shc mRNA表达水平显著高于早卵裂胚胎(P<0.05);将绵羊早期胚胎中的p66Shc基因敲减后,与对照组相比,其胚胎内p66Shc mRNA水平、p66Shc蛋白水平显著降低,ROS和8-OHdG水平显著低于对照组(P<0.05);基因敲减后桑椹胚发育率显著升高(P<0.05).[结论]低水平的p66shc可以提高绵羊早期胚胎对氧化应激的抵抗力,并进一步提高其发育能力.     

dw基因mRNA在矮小型优质肉鸡S2系不同组织的表达差异分析

以矮小型优质肉鸡品系(S2系)为素材,采用RT-PCR技术分析dw基因在12周龄S2鸡肝脏、胸肌、腿肌和骨膜中等组织中的表达情况。结果表明,dw基因在肝脏、胸肌、腿肌和骨膜中均有表达,但在不同组织中的表达量不同。公母鸡在肝脏的mRNA水平(公鸡拷贝数为11.2±1.11,母鸡拷贝数为10.4±0.51)均显著高于胸肌、腿肌和骨膜(P<0.05);公母鸡在骨膜中的mRNA表达量(公鸡拷贝数1.8±0.37,母鸡拷贝数1.6±0.4)最低,且显著低于肝脏、胸肌和腿肌(P<0.05);母鸡在腿肌中的表达量(拷贝数为8.0±0.32)显著高于胸肌中的表达量(拷贝数为4.0±0.32)(P<0.05);公鸡在腿肌和胸肌中的表达量差异不显著。dw基因mRNA在肝脏和骨膜中的表达无性别效应,在胸肌和腿肌中的表达有明显的性别效应。     

dw基因mRNA在矮小型优质肉鸡S2系 不同组织的表达差异分析

以矮小型优质肉鸡品系(S2系)为素材,采用RT-PCR技术分析dw基因在12周龄S2鸡肝脏、胸肌、腿肌和骨膜中等组织中的表达情况.结果表明,dw基因在肝脏、胸肌、腿肌和骨膜中均有表达,但在不同组织中的表达量不同.公母鸡在肝脏的mRNA水平(公鸡拷贝数为11.2±1.11,母鸡拷贝数为10.4±0.51)均显著高于胸肌、腿肌和骨膜(P<0.05);公母鸡在骨膜中的mRNA表达量(公鸡拷贝数1.8±0.37,母鸡拷贝数1.6±0.4)最低,且显著低于肝脏、胸肌和腿肌(P<0.05);母鸡在腿肌中的表达量(拷贝数为8.0±0.32)显著高于胸肌中的表达量(拷贝数为4.0±0.32)(P<0.05);公鸡在腿肌和胸肌中的表达量差异不显著.dw基因mRNA在肝脏和骨膜中的表达无性别效应,在胸肌和腿肌中的表达有明显的性别效应.     

猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响

【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ,TGEV）陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV 陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）,采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况,Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响,采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响,通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因,经过测序鉴定,3a基因的大小为213bp,3b基因的大小为732bp;经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析,3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%-100%,氨基酸同源性为98.6%-100%;3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%-99.9%,氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后,经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35kD的3a-GFP和54kD的3b-GFP的融合蛋白,与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达,流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多,实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的mRNA水平高于对照组细胞（IEC和IEC-GFP）,同时Western blotting分析结果显示表达3b蛋白的细胞中Cyclin A 蛋白水平表达量高于对照组,并且Cyclin B1的表达量低于对照组细胞,差异显著;TGEV非结构蛋白3a对细胞周期没有影响。实时荧光定量PCR分析结果显示,表达TGEV非结构蛋白3a的细胞中GRP78的mRNA水平高于对照组, Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于对照组,差异显著,说明非结构蛋白3a可以使GRP78表达水平的上调;TGEV非结构蛋白3b对GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV陕西株的非结构蛋白3a和3b在IEC细胞中成功表达,3a蛋白可以引起细胞内质网应激反应,3b蛋白通过使细胞周期蛋白Cyclin A表达上调并且使Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于G2/M期。     

毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究

[目的]本试验旨在研究毛喉素(FSK)对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及机制。[方法]体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞,预培养24 h。用10 nmol·L~(-1) FSK处理细胞48 h,检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达状况;处理96 h后检测孕酮(P_4)水平及类固醇合成相关蛋白的表达水平。[结果]与对照组相比,FSK改变了细胞形态,使细胞直径增大,细胞内脂滴含量增加(P0.01);FSK降低细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达水平(P0.01);FSK降低颗粒细胞标记基因促卵泡素受体(FSHR)基因表达水平,提高黄体细胞标记基因前列腺素受体(PTGFR)和促黄体素受体(LHCGR)基因表达水平(P0.01);FSK促进P_4分泌,提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平(P0.01);从细胞周期看,FSK降低了细胞周期素B1(CCNB1)、细胞周期素D1(CCND1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)基因表达水平(P0.01),而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B(P21~(cip1)/P27~(kip1))基因表达水平上调(P0.01),并将细胞周期阻滞在G0/G1期。[结论]FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢以及退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。     

人参皂苷促进小鼠成骨细胞增殖的作用及机制

目的 观察人参皂苷（Ginsenoside,GSS）对小鼠成骨细胞增殖活性的影响,并探讨其作用机制。方法 采用MC3T3-E1小鼠成骨细胞系, 加入不同浓度的GSS （3.125~50 μg/mL） 培养后,MTT法检测GSS对成骨细胞增殖的影响,荧光定量RT-PCR法检测不同浓度各组细胞内p21和p27 mRNA的表达水平,并采用Western-blot检测细胞周期相关蛋白表达。结果 与空白对照组相比,3.125~50 μg/mL的GSS在24、48 h时均能够显著促进成骨细胞的增殖(P<0.01或0.05),其作用具有时间依赖性和浓度依赖性。50、25 μg/mL的GSS能够显著抑制p21和p27的mRNA表达(P<0.01),而12.5 μg/mL的GSS对其表达无影响。50、25 μg/mL的GSS抑制了细胞周期抑制蛋白p21及p27表达水平并上调Cyclin D1表达(P<0.01或0.05)。结论 GSS能够通过上调Cyclin D1表达,抑制p21和p27表达,进而促进小鼠成骨细胞增殖.     

鹿茸再生关键组织角柄骨膜基因组DNA甲基化分析

为研究鹿茸再生过程中的分子调控机制,利用荧光标记的甲基化敏感扩增多态性(Fluorescence-labeled methylation sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)方法,分别从组织和细胞水平检测致敏区角柄骨膜(Potentiated pedicle periosteum,PPP)和休眠区角柄骨膜(Dormant pedicle periosteum,DPP)的基因组DNA甲基化水平。结果表明:无论在组织还是细胞水平,PPP的DNA甲基化水平均低于DPP,并且差异显著(P0.05)。通过人工制造致敏区角柄骨膜(artificial PPP,a PPP)对试验结果进行了功能验证,证明鹿茸再生过程中,DNA甲基化是重要的分子调控机制,DNA去甲基化是激活鹿茸角柄骨膜再生能力的先决条件。     

miR-6523a对延边黄牛垂体细胞中 生长激素分泌的影响

为研究血液外胞体中miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,本研究选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中显著差异表达的miR-6523a,利用实时定量PCR(qPCR)和Western Blot技术,研究了miR-6523a对延边黄牛垂体细胞中GH分泌水平的影响及miR-6523a与靶基因间的调控机制。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因系统结果显示,miR-6523a靶向了SSTR5的3′非翻译区(UTR);qPCR和Western Blot检测结果显示,与对照组相比,添加miR-6523a-mi能极显著提高延边黄牛垂体细胞中GH mRNA和蛋白的表达(P0.01),而添加miR-6523a-in,GH mRNA和蛋白的表达有所降低,但和对照组相比差异不显著(P0.05);与对照组相比,添加miR-6523a-mi能极显著抑制SSTR5 mRNA和蛋白的表达(P0.01),而添加miR-6523a-in,SSTR5 mRNA和蛋白的表达均有所提高,但和对照组相比差异不显著(P0.05)。本研究表明,miR-6523a可通过调节SSTR5基因的表达而调控垂体细胞中GH的分泌,本研究结果将为研究外胞体miRNA调控动物生长发育机制提供理论依据。