利用SSCP技术分析甘蓝型油菜10个功能基因序列差异

以甘蓝型油菜SI-1300和Eagle为材料,利用DNA单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)技术,对10对功能基因特异性引物进行多态性分析,每对引物均检测到1个多态性位点。随后随机挑选10个多态性片段进行测序,并利用bl2seq软件比较测序序列与基因原始序列。结果显示测序序列与所对应的基因原始序列之间相似程度平均高达98%,差异碱基数平均仅为2.3个。进一步选取5对引物比较分析两个材料间的差异扩增片段序列,发现差异扩增片段在2个材料中高度保守,平均相似度达97%;在所测序的5对引物扩增序列中,共存在39个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)和5个插入/缺失突变(insertion-deletions, INDELs),SNP和INDEL的发生频率分别为1 SNP/30 bp和1 INDEL /233 bp。结果表明,SSCP标记能够真实代表原始功能基因,甘蓝型油菜功能基因序列在不同材料间高度保守,其遗传变异类型主要来源于SNP。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆

此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。     

重叠延伸PCR技术在单碱基定点突变中的作用

氨基酸通透酶(amino acid permease,AAPs)是一种跨膜转运蛋白,广泛参与植物体内氨基酸的吸收与转运。本试验通过重叠延伸PCR技术对氨基酸通透酶基因进行单碱基定点突变,以便为今后研究植物对外源氮的吸收与利用率奠定基础。本研究根据Tair数据库中拟南芥AtAAP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计含有1个突变位点的2对互补的定点突变引物和1对带有pCAMBIA3301-GFP载体的多克隆位点的接头引物,以野生型拟南芥叶片的cDNA为模板,进行3次PCR扩增,将获得的突变基因片段连接到pCAMBIA3301-GFP载体上,转化DH5α感受态细胞。将筛选的阳性菌株送至公司测序,测序结果表明拟南芥AtAAP1基因的第908位碱基A突变为T,实现了单碱基定点突变,这与预计结果相同,说明成功依靠重叠延伸PCR技术做到目的基因的定点突变。该技术能方便快速地获得定点突变序列,为进一步研究AtAAP1基因的功能奠定了基础。     

猪肺炎支原体地方毒株P97-R1基因序列分析及原核表达

为克隆和表达猪肺炎支原体(Myeoplasma hyopneumoniae) 地方毒株Z株P97-R1基因,探索不同菌株P97-R1基因的差异及其蛋白作为诊断抗原的可能性,本研究根据GenBank登陆的猪肺炎支原体(Mhp)232株P97基因,使用Primer Permier 5.0和DNAman设计引物,以猪肺炎支原体地方毒株Z株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出了P97-R1基因片段,并将该基因片段连接到T-easy和pET-32a载体上分别进行测序和原核表达。测序结果与参考株232株序列对比分析发现Z株P97-R1区发生了多处碱基突变;经DNAstar软件分析表明Z株包含11个5aa重复序列,232株P97-R1区包含15个5aa重复序列,推测Rl重复序列的差异与菌株毒力强弱有关。Z株P97-R1基因原核表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量约为30 KD的蛋白,经Western-blot鉴定表明该表达蛋白具有免疫原性。这为Mhp的诊断、预防及进一步深入研究奠定了基础。     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆及序列分析

参照GenBank中NDV的核酸序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增,基因并得到长约1.7 kb的全基因片段,并将其构建到pMD.19T载体上.核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长1 662 bp,编码553个氨基酸,与GenBank下载的13株参考毒株,基因比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%～99.2%和96.9%～98.7%;但与IJasota、F48E9及Bl等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为88.6%～91.5%.NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F-I-G119,属于基因Ⅵ NDV.     

山羊FGF5基因单核苷酸多态性群体遗传学分析

为了研究成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因在山羊被毛生长中的的作用,进一步寻找与山羊被毛生长相关的遗传标记,为山羊绒毛性状的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据,根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的同源序列设计引物对山羊基因组进行PCR扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片断为山羊的FGF5基因片断。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和文登奶山羊品种的多态性,结果表明:FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性,而在P3和P4中没有发现多态。经克隆测序分析,位于外显子1的引物1内存在A→G突变;引物2中发生了碱基序列C→T的突变,这2个突变位点均没有引起编码氨基酸的改变,属于同义突变。对不同山羊品种的基因型和基因频率统计结果表明,引物1中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊、文登奶山羊均以等位基因B为主,且不同群体均处于Hardy-Weinberg平衡;引物2中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊均以等位基因E为主,而文登奶山羊的基因型频率与其他品种有显著差异;内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态,而文登奶山羊的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态。     

荧光素酶表达载体yy621的构建及鉴定

在载体yy449的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间增加BglⅡ限制性内切酶位点,构建yy621载体。用PCR的方法分别扩增CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因。引物设计要满足如下条件:CaMV 35S minimal启动子序列扩增片段的上游应包括Bam HⅠ、下游应包括BglⅡ限制性内切酶位点;LUC基因序列扩增片段的上游应包括BglⅡ、下游应包括XbaⅠ限制性内切酶位点。以上两个片段先用BglⅡ限制性内切酶消化后进行连接,得到CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间含BglⅡ限制性内切酶的识别位点的片段,然后再用Bam HⅠ和XbaⅠ限制性内切酶进行消化,插入到载体yy449的Bam HⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,替换原有的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列。经菌落筛选、PCR鉴定和测序验证,阳性菌落中的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间包含BglⅡ限制性内切酶的识别位点,载体yy621构建成功。本实验中构建的荧光素酶表达载体yy621,适于今后用抗性相关基因替换LUC基因,测定合成启动子对抗性相关基因的具体调控与赋予植物对不良环境的具体抗性表现,或者用全长启动子序列替换CaMV 35S minimal启动子序列(-46～+1),对进一步观察LUC基因的表达调控具有重要的意义。     

小麦抗叶锈病基因Lr45的SSR分子标记

用定位于2A染色体的59对SSR、EST-SSR引物,对小麦抗叶锈病基因Lr45进行分子标记,共筛选出11对揭示TcLr45多态性的引物。用157株F₂抗感群体对这11对引物进一步检测,得到4个与Lr45共分离的SSR标记(Xgwm95、Xgwm47、Xgwm372和Xgwm122)。将经PAGE检测的标记Xgwm95的抗感差异带及Xgwm47的抗性片段进行克隆测序发现其中含有微卫星序列,且均为二核苷酸重复。Xgwm372和Xgwm122经琼脂糖凝胶电泳发现与Lr45的供体黑麦有共同的标记片段,可直接用于分子标记辅助选择。     

柑桔线虫抗性主基因座Tyr1的特异标记开发与遗传作图改进(英文)

本文利用先期从BAC文库获得的NBS-LRR类候选抗病基因克隆序列Pt8a和Pt9a,进一步开发与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1连锁的分子标记。以Pt8a和Pt9a序列作探针,通过高密度克隆印迹杂交,从BAC文库筛选出200个以上的阳性克隆,以阳性克隆插入序列设计引物,对柑桔抗线虫材料和感线虫材料开展以PCR扩增为基础的集群分离分析,发现一部分克隆序列与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1紧密连锁;再通过染色体步行测序,分别从3个克隆（7A4,4L17和29F20）获得3个完整的NBS-LRR类候选抗病基因序列。从此类序列开发更高特异性的分子标记,并在利用原有分子标记的基础上,对柑桔线虫抗性杂交后代群体（9145 family）构建较高密度的遗传图谱;同时,将新开发的分子标记应用于柑桔衰退病抗性杂交后代群体（9401 family）,以初步估算柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr]与柑桔衰退病抗性基因Ctv的遗传距离。     

生防细菌NCD-2中抑菌功能相关基因的定位及克隆

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株是一株有效防治棉花黄萎病的细菌,它通过产生抑菌物质达到对大丽轮枝菌的抑制作用。以该菌株作为有效成分的微生物农药已通过国家农药登记。通过原生质体转化法将含有转座子mini-Tn10的质粒pHV1249转入枯草芽孢杆菌NCD-2中,获得转化子。对转化子通过高温诱导转座子转座,获得4 000个NCD-2菌株的突变子。对这些突变子进行对大丽轮枝菌的抑菌作用测定,筛选到2株抑菌作用增强的突变子和4株抑菌作用降低的突变子。采用染色体步移技术对此6个突变子中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和测序,结合枯草芽孢杆菌168菌株的全基因组序列对测序结果进行序列同源性和基因定位分析,结果表明:抑菌作用增强的2个突变子中,转座子插入到一个功能未知的基因内部,此基因与枯草芽孢杆菌168菌株中的yvoA基因的同源性为98%;抑菌作用降低的4个突变子中,转座子插入位点对应于枯草芽孢杆菌168菌株中的phoP基因内部,插入位点的侧翼序列与枯草芽孢杆菌168菌株中的phoP基因的同源性达到98%。     

高产纤维素酶菌株筛选及诱变选育

为了得到高产纤维素酶的菌株,达到缓解纤维素酶活不高、纤维素酶供不应求现状的目的。从自然界中筛选出较优良的产纤维素酶菌株并对其进行紫外、60Co-γ射线诱变选育获得高产纤维素酶活的突变株。从自然界筛选出来的菌株通过菌落、菌丝体以及孢子丝的形态初步鉴定为放线菌并命名为XZ-33。对XZ-33进行复合诱变选育并根据致死率和诱变剂量以及正突变率的相互关系,得出合适的诱变剂量即：紫外照射7 min,辐照剂量为0.6 KGy的γ射线对产纤维素酶的出发菌进行诱变,得到高产纤维素酶的突变株UV-Co16,其CMCase酶活达到66.15 IU/mL,以及PFAase酶活2.91 IU/mL,分别是出发菌的3.17倍和2.42倍。该突变株的获得为微生物发酵生产乙醇奠定了基础。     

β-甘露聚糖酶高产菌株的紫外线诱变选育

为给生产实践提供具有更高产酶量的优良菌株,本研究以实验室保藏的一株地衣芽孢杆菌HDYM-04为原始出发株,经自然筛选、紫外线诱变,选育出一株β-甘露聚糖酶高产菌株U2-12。结果表明：依据致死率所选用的最佳诱变剂量为照射距离50 cm,照射时间为10 s,此时,菌株的总突变率为76.11%,正突变率为54.60%,负突变率为20.92%,地衣芽孢杆菌U2-12的产β-甘露聚糖酶能力是原始未紫外线诱变的出发株的242.19%,其遗传性状稳定。本研究可以为后续试验及生产实践提供优势产酶菌株,并为研究紫外线对β-甘露聚糖酶产酶基因的影响提供先决条件。     

高产核酸酶菌株的分离、筛选与诱变育种

为获得具有自主知识产权,满足生产需求的高产核酸酶P1的菌株。以2%RNA作为唯一碳、氮源的筛选培养基,从桔园土壤中初步筛选出65株具有产生核酸酶P1的菌株。结果表明：以其中酶活较高的YC34号菌株为出发菌株,该菌株的初始酶活性为127.3 U/mL,通过紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变3种方式依次进行复合诱变处理后,获得酶活最高的突变株YC34-1,其粗发酵液的酶活达到360.7 U/mL,较原始出发菌株酶活增长了183.3%,具有良好的应用开发潜力。经初步形态学鉴定该菌株可归属为青霉属柑桔青霉(Penicillium citrinum)。     

高活性苎麻脱胶菌的选育

苎麻生物法脱胶是一种绿色环保的脱胶方法,具有脱胶质量稳定和不损伤纤维的特点。为了选育稳定、高活性苎麻脱胶菌,以透明圈法和摇瓶发酵法从土壤中分离初筛得到的微生物脱胶菌株(15号)作为出发菌株,采用紫外和亚硝酸复合诱变处理,以青霉素抗性为标记,对大量初筛得到的突变株进行筛选,最终选育得到4株高活性苎麻脱胶菌株。与出发菌株相比,其中U-4使木聚糖酶活提高了15.81%,果胶酶活提高了6.49%,纤维素酶活降低了37.45%,残胶率降低了16.89%。     

猪瘟病毒河南野毒株E2基因的克隆及序列分析

【研究目的】旨在了解猪瘟病毒流行毒株的变异情况,为防制猪瘟提供科学依据。【方法】根据GenBank上已发表的猪瘟石门株E2基因序列,设计合成了1对特异引物,应用RT-PCR技术对河南省一猪场采集的疑是猪瘟病料的猪瘟野毒E2基因进行扩增,将扩增的E2基因克隆于pGEM-T Easy载体,对其进行了序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与HCLV株、C株、Alfort株和Brecsia株进行了同源性比较及遗传进化分析,并构建了CSFV的遗传发生树。【结果】通过PCR扩增得到与预期大小相等的产物,克隆测序验证是E2基因;所扩增的流行野毒与HCLV株、C株、Shimen株、Alfort株和Brecsia株核苷酸序列同源性分别为99.0%,96.5%,93.5%,94.4%和89.9%;氨基酸同源性分别97.8%,94.0%,92.6%,92.0% 和91.0%;所绘制的遗传发生树显示所测得流行野毒与C株、HCLV株关系较近。【结论】所测的流行株与与我国使用的C株疫苗毒核苷酸同源性很高,说明现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。     

可乐猪Ghrelin基因多态性及其对肉质性状的遗传效应分析

根据GenBank上的Ghrelin基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从可乐猪肌肉组织基因组中扩增出了包含Ghrelin基因全序列的特异片段,包括第一、第二外显子和第一内含子DNA序列,并进行直接测序,分析该基因与可乐猪12项肉质性状的关联性,结果表明：在Ghrelin基因第一内含子上检测到1个单碱基突变：G252A,表现出纯合型GG和杂合型GA两种基因型,其中GG基因型频率高于GA基因型频率,达65.4%,等位基因G为优势等位基因,表现为低度多态。χ2检验表明,该SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P﹥0.05)。最小二乘分析显示,Ghrenlin基因252位点对可乐猪的肉质性状无显著影响(P>0.05)。     

一株产胶霉菌素菌株的ARTP诱变及筛选

试验旨在选育出胶霉菌素高产菌株,以胶霉菌素产生菌TY-009为初始菌株,利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对产胶霉菌素的绿色木霉菌株进行诱变处理,并设置时间梯度,检测不同处理时间样品的胶霉菌素产量。通过平板筛选以及摇瓶复筛选出8株正突变菌株,其中产率最高达到0.86 mg/m L,较初始菌株的产率提高了45.76%。ARTP诱变方法快速、高效,对绿色木霉菌株的诱变效果良好,在提高胶霉菌素产量方面有很好的应用前景。     

Development and application of a molecular marker for TMV resistance based on <Emphasis Type="Italic">N</Emphasis> gene in tobacco (<Emphasis Type="Italic">Nicotiana tabacum</Emphasis>)

Tobacco mosaic virus (TMV) caused serious loss in yield and quality of tobacco every year. It is a long-term goal to improve the tobacco resistance against TMV by tobacco breeding. N gene was the firstly reported TMV-resistant gene, which showed resistance against all Tobamoviruses except the Ob stain and belonged to the toll-interleukin-1 receptor/nucleotide-binding site/leucine-rich repeat class of plant resistance (R) genes. At present, N gene had already been widely used in tobacco conventional breeding, but there is rare available molecular maker used in marker-assisted selection of TMV resistance. In this study, we designed a pair of primers that specific amplify N gene fragment based on the sequence of N gene intron III, named N-marker. Then, we identified TMV resistance by two selecting methods, PCR with N-marker and inoculated with the TMV-C strain. Results from the two method showed that (1) 13 varieties among 67 tobacco varieties displayed hypersensitive reaction when inoculated with the TMV-C strain, also contained N gene fragments screened by PCR with N-marker; (2) 105 strains of 200 BC1 strains showed resistance against TMV when inoculated with TMV-C strain, meanwhile, 103 of the 105 strains contained N gene fragment verified by PCR with N-marker. Therefore, the N-marker is reliable for high throughput screening of germplasm resources and tobacco breeding materials in selection of N-mediated TMV resistance. Our study not only developed a molecular marker for tobacco breeding, but also identified new germplasm resources that are resistant to TMV.     

长枝木霉T6微波诱变菌株筛选及其耐盐性测定

为了获得高效耐盐木霉菌株,本试验以长枝木霉T6菌株为出发菌株,采用微波诱变处理和NaCl溶液模拟盐胁迫条件,并结合菌丝生长速率,产孢量及菌丝干重等指标筛选最佳诱变耐盐菌株。结果表明,微波诱变对长枝木霉T6菌株生长具有明显影响,并随着微波诱变处理时间的不同其影响作用显著不同,尤其当诱变时间为60 s时,其诱变菌株的菌落直径、菌丝干重和产孢量显著高于原出发菌株。微波诱变时间为60 s条件下,获得的诱变菌株生长速率显著高于其他处理,较原出发菌株表现出较强的耐盐性,培养72 h较原出发菌株生长速率平均提高32.98%。该试验利用微波诱变处理选育和获得了高产和高效的耐盐性木霉菌株,为今后多功能木霉制剂的研发应用及推广奠定理论基础。