农杆菌介导油菜油体基因与碱性成纤维细胞生长因子融合基因转化油菜研究

[目的]利用植物转基因技术,生产药用蛋白。[方法]以带柄子叶作为转化受体,利用根癌农杆菌介导法将油菜油体基因与bFGF的融合基因转入油菜中,在获得潮霉素（Hyg）抗性植株的同时,对油菜的再生条件进行优化,并对获得的抗性苗进行PCR和Southern检测。[结果]油菜最佳转化再生条件为外植体预培养2d,共培养3d,茵液浓度OD值为0．3,侵染时间5min。[结论]该研究中,融合基因已成功整合到油菜基因组中,为以后转基因植物种子的蛋白提取、分离和纯化奠定了基础。     

油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1的克隆及其原核表达

克隆油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1,实现该基因在原核系统中重组表达,为研究其功能奠定基础。采用TRIzol法提取总RNA,通过RT-PCR法扩增BnLIP1编码序列,构建原核表达载体pEL1并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE检测目的蛋白。根据GenBank报道的序列设计引物,从萌发的油菜种子黄化幼苗中成功克隆到BnLIP1的编码序列,长度为1170bp。将该编码序列构建到原核表达载体pET32a( )并与标签序列融合,在E.coliBL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的BnLIP1蛋白,大小约为61kDa。首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达,为GDSL脂肪酶Bn-LIP1蛋白的分离纯化及活性研究奠定了基础。     

白菜型油菜BrDAD1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了白菜型油菜BrDAD1基因及自身的启动子基因Pro-DAD1,并将其分别克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因及启动子全序列。结果表明,该基因及启动子全长分别为1 270 bp与1 335 bp。将白菜型油菜BrDAD1基因反向克隆到植物表达载体pCambia 1300的自身启动子基因Pro-DAD1启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体pCamDAD1。     

油菜BnPMEI1基因的克隆及功能分析

以高抗菌核病的油菜品种湘油15和高感菌核病的油菜品种98C40为材料，采用RT–PCR方法克隆BnPMEI1基因的编码区全长，利用生物信息学软件和实时荧光定量PCR分析BnPMEI1的结构和表达特性，并构建该基因超表达载体，分析该基因的功能。序列分析结果表明，该基因编码区全长615bp，编码204个氨基酸，具有1个信号肽和1个PMEI结构域，属于PMEI家族基因，命名为BnPMEI1(GenBank登录号为ON254917)。表达分析结果表明，BnPMEI1在根、茎、花、叶、角果皮和籽粒中均有表达，在叶中的表达量最高，根中的表达量最低；湘油15的茎、叶、花中的表达量均显著高于98C40的。在核盘菌、茉莉酸甲酯(Me JA)和水杨酸(SA)处理下，BnPMEI1在湘油15中的表达上调，在98C40中的表达则受到抑制；乙烯处理下，BnPMEI1在2个品种中的表达均下调，在湘油15中下调的幅度更大；离体叶片接种结果显示，超表达Bn PMEI1的油菜突变体叶片病斑明显小于野生型叶片的。综合分析，BnPMEI1基因可能介导了SA和茉莉酸途径的调控，诱导油菜菌核病抗性的提高。     

农杆菌介导的成纤维细胞生长因子-21基因转化甘蓝型油菜研究

【目的】利用基因工程技术获得FGF21转基因油菜植株,为FGF21蛋白生产体系的建立奠定基础。【方法】将人源FGF21基因的cDNA序列,根据植物偏好密码子进行改造,并通过PCR拼接技术扩增FGF21全长基因,将该基因插入油菜油体特异表达载体,通过冻融法转到根瘤农杆菌LBA4404,叶盘法转化甘蓝型油菜"沪油15",并对转基因油菜进行PCR检测和Southern blot分析,最后对FGF21蛋白在转基因油菜种子中的表达的进行了Western blot分析。【结果】合成了FGF21全长基因,成功构建了含FGF21基因的植物双元表达载体p1390yoFGF21,并建立了油菜遗传转化体系。通过油菜遗传转化获得2株转基因植株,PCR扩增和Southern blot检测证实,重组FGF21基因已整合到油菜基因组中;Western blot分析检测显示,FGF21在转基因油菜种子蛋白中具有一定水平的表达量,并具有良好的抗原性。【结论】FGF21基因被成功整合到油菜基因组中,收获的T0代种子蛋白具有良好的抗原性。     

甘蓝型油菜酯酶基因BnLIP2的克隆及其植物超表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜BnLIP2基因,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列.结果表明,该基因全长为1 170bp.将甘蓝型油菜BnLIP2基因定向克隆到植物表达载体pCambial300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

油菜(Brassica napus L.)BnPGIP基因克隆及其表达分析

以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99％,编码区序列全长9...     

油菜COR基因的克隆及原核表达

以冬油菜陇油6号叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因编码区序列,全长390 bp。将其与大肠杆菌表达载体p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-COR,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约14.3 k D的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

油菜油体蛋白基因启动子的克隆及在油葵中的功能验证

利用PCR技术,从油菜(Brassica campestris)基因组DNA中克隆20 ku油体蛋白基因上游903 bp的调控序列NOP,将其与GUS基因融合构建植物表达载体,利用花粉管通道法转化油葵并进行PCR扩增,组织化学染色检测启动子和GUS基因在油葵基因组中的整合和表达情况。结果表明,NOP序列1~903 bp与报道序列同源性为95%,包含驱动基因表达的重要元件及驱动基因在种子中特异表达所必需的核苷酸序列;目的片段已整合到油葵基因组中,NOP具有种子特异性启动子的功能,能够驱动GUS基因在油葵种子中特异性表达,而在油葵根、茎、叶中均不表达。     

甘蓝型油菜F3’H基因反义植物表达载体的构建

类黄酮3’-羟化酶(F3’H)是类黄酮途径中的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。通过PCR法扩增了甘蓝型油菜(Brassica napus L.)F3’H基因的一段特异保守片段F3’HA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了F3’H反义植物表达载体pCAMBIA2301-F3’HA,通过PCR鉴定和酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。为进一步研究F3’H基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和该基因的代谢调控网络奠定基础。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

以pmf为筛选标记的水稻转基因研究

[目的]建立一种快速、高效的甘露糖安全筛选体系。[方法]以绿色荧光蛋白（GFP）编码基因为报告基因,用农杆菌介导的方法将磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）转入水稻品种皖粳97,并对转化和筛选条件进行优化。[结果]受体品种皖粳97,在32oC光照条件下诱导愈伤的出愈率可达90．3％,且生长较快;培养基中甘露糖筛选压力以5∥L蔗糖＋15g／L甘露糖较为适宜,在该条件下筛选21d,进而分化成苗。转化频率可达20．6％。[结论]该研究确立的甘露糖筛选体系,能明显缩短筛选周期、提高转化效率,有利于转基因水稻的安全生产。     

农杆菌介导的几个甘蓝型油菜下胚轴转化体系研究

选择四川目前推广的中双9号等8个甘蓝型双低常规油菜品种,以5~6 d无菌苗下胚轴为外植体,MS培养基为基本培养基,设置了8组激素配比组合,探讨其对植株再生的影响,初步建立了不同油菜品种下胚轴的高效再生体系。选择其中再生频率较高的4个品种:中双9号、中双7号,中双6号,川油18号下胚轴作为农杆菌转化材料,对影响转化的相关因素进行研究,建立了4个品种下胚轴的遗传转化体系,并运用该转化体系将pta与sb401融合基因导入,成功获取了一批经PCR检测的转基因植株。     

草莓annfaf基因反义融合表达载体构建及转基因植株的获得

 【目的】建立研究草莓果实膜联蛋白基因annfaf功能体系。【方法】利用反义基因技术将从草莓成熟果实中分离克隆的annfaf基因定向克隆至植物中间表达载体pROKⅡ，构建了annfaf反义融合基因植物表达载体pRRJ4，通过根癌农杆菌EHA105将其导入草莓基因组。对获得的抗性植株进行PCR和Southern检测分析。【结果】表明该反义基因已整合到草莓基因组中。【结论】可进一步筛选annfaf基因表达缺陷型植株，用于探讨annfaf在非跃变型果实草莓成熟中的调控作用，为培育草莓新品种提供中间材料。     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

农杆菌介导外源基因转化棉花上胚轴方法的研究

[目的]介绍一种获得棉花转基因植株的新方法。[方法]以棉花感受态萌动的上胚轴作为外源基因转化的受体,用农杆菌介导法将携带有筛选标记NPTII(新霉素磷酸转移酶)基因及GFP(绿色荧光蛋白)报告基因导入棉花,研究了农杆菌介导法用于棉花感受态萌动上胚轴转化的预培养时间,浸菌时间,共培养时间及抗生素处理浓度等。[结果]在新疆棉花离体培养植株直接再生植株基础上,经3~5d预培养处理过的棉花上胚轴,在浸菌15 min共培养2 d后,经50 mg/L kan筛选,用1 000 mg/L头孢霉素抑菌,并用相对高含量细胞分裂素和低含量生长素的组合对其进行直接出芽培养,从而获得抗性小苗。[结论]用农杆菌转化处理棉花上胚轴是一种操作简单、重复性好、非基因依赖型的转化方法。     

Transgenic Rape with hrf2 Gene Encoding HarpinXooc Resistant to Sclerotinia sclerotinorium

The objective of this study was to increase the resistance of rape using the method of transformation. The gene hrf2 derived from Xathomonas oryzae pv. oryzicola encoding harpinxooc protein was constructed into transgenic vector pCAMBIA1301. The cotyledonal petiole segments from rapeseed variety Yangyou 4 were infected by Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404/pCAMBIA1301-hrf2. Hygromycin-resistant green shoots were obtained. Successful integration of the foreign gene into the genome of the rapeseed variety Yangyou 4 was confirmed by PCR, RT-PCR, and β-glucuronidase analyses. Disease bioassays of transgenic plants revealed an improved resistance of transgenic plants to Rape sclerotiniose. In brief, the hrf2 gene can be transferred into rape using the method of Agrobacterium-mediated transformation, which increased the resistance to Sclerotinia sclerotinorium in the transgenic plant.     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。