大鼠肺及其微血管内皮细胞磷酸二酯酶4表达及活性与清热药影响

通过检测肺与肺微血管内皮细胞（PMVEC）Ⅳ型磷酸二酯酶（PDE4）的表达及其活性,探讨入肺经中药对PMVEC环腺苷酸（cAMP）磷酸二酯酶（PDE）活性的影响,为筛选作用于PMVEC的PDE4抑制剂类抗炎药积累资料。本试验采用RT-PCR测定PDE4的表达,应用高效液相色谱（HPLC）检测酶反应前后大鼠肺组织与PMVEC的cAMP变化,计算PDE活性。结果显示：PDE4A、4B、4C、4D在肺与PMVEC内均有表达;17味入肺经清热药均对肺组织cAMP-PDE酶活性有不同程度的抑制作用,其中黄芩、黄药子、青蒿抑制率较高对肺组织酶分别为：75.37%、72%、61.26%,对PMVEC分别为：66.1%、63.54%、59.39%。由此可见,PDE4所有亚型在肺与PMVEC内均有表达;黄芩、黄药子、青蒿等入肺经的清热药能够抑制肺组织和PMVEC内cAMP-PDE活性;以cAMP-PDE活性为指标,有望筛选出其特异性PDE4抑制剂,并揭示入肺经清热药的作用机制。     

猪中性粒细胞磷酸二酯酶基因表达及活性研究

 【目的】通过对猪中性粒细胞磷酸二酯酶（PDE）基因表达、活性及特异性抑制剂实验检测，研究其存在的主要PDE亚型及在体外的活性，为探讨PDE在中性粒细胞的分布、活性变化及对cAMP、cGMP调节与中性粒细胞功能关系提供依据。【方法】采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PDE基因在猪中性粒细胞的表达，以高效液相色谱（HPLC）检测环核苷酸在PDE反应前后的含量变化，计算PDE活性。【结果】在检测的18个PDE亚型中，PDE1B、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A 共15个PDE mRNA在猪中性粒细胞表达，特异性抑制剂实验表明PDE4、PDE5分别为水解cAMP、cGMP的主要PDE亚型；cAMP/cGMP-PDE在10～40 μl范围内，与其活性存在良好的线性关系（r＝0.9929/0.9992）。【结论】猪中性粒细胞至少存在15个PDE亚型，其中PDE4、PDE5为主要存在的2个亚型，PDE样品量在一定范围内与其活性存在良好的线性关系，可作为筛选PDE型中性粒细胞功能调节剂的方法。     

清热中药对大鼠肺及其微血管内皮细胞磷酸二酯酶活性的影响

采用组织贴块法培养分离大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC),以高效液相色谱(HPLC)检测环核苷酸(cAMP)在酶反应前后磷酸二酯酶(PDE)的变化计算PDE活性,并分析药物对其影响,为研究PMVEC特异性PDE抑制剂和清热药作用机理积累资料。结果显示:分离培养经CD31鉴定的PMVEC,其酶量在5~20μL范围内与PDE活性存在良好的线性关系(r=0.9929);17味入肺经清热药均对肺组织cAMP-PDE酶活性有不同程度的抑制作用,其中黄芩、黄药子、青蒿抑制率较高,对肺组织酶分别为:75.37%,72%,61.26%,对PMVEC分别为:66.1%,63.54%,59.39%,结果提示以cAMP-PDE活性为指标,有望筛选出其特异性PDE抑制剂,并揭示入肺经清热药的作用机制。     

ZD制剂对小鼠巨噬细胞cAMP、cGMP、PDE含量及cAMP/cGMP的影响

ZD制剂由川椒、茵陈、白芨等12味中草药经研磨、煎煮、浓缩再配以适当佐剂制成,是治疗马属动物肢蹄软组织损伤的经典处方,具有确实的临床疗效。cAMP和cGMP是真核细胞内的炎症反应调节因子,许多致炎因子通过破坏或改变炎症细胞内cAMP/cGMP的值起到致炎或抗炎作用。此次实验,目的:探讨ZD制剂对炎症过程中巨噬细胞中cAMP、cGMP、PDE含量及cAMP/cGMP比值的影响。方法:用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞,构建炎性细胞模型。用5种不同浓度的ZD制剂进行实验。采用ELISA法检测ZD制剂干预前后细胞cAMP、cGMP及PDE的变化,并计算cAMP/cGMP比值的变化。结果:ZD制剂可抑制模型细胞中PDE的表达并提高cAMP含量及cAMP/cGMP的比值;对cGMP未见明显影响。表明ZD制剂抗炎机制与抑制PDE表达,高cAMP含量及cAMP/cGMP比值密切相关。     

牛蒡子苷对小鼠原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶活性及细胞生长的影响

 【目的】以茶碱为参照,观察中药成分牛蒡子苷对原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）活性及蛋白质合成的影响,探讨中药通过抑制PDE促进肌肉生长的作用及机理。【方法】分离1～3日龄ICR小鼠四肢肌肉用于骨骼肌原代细胞培养,在培养至第5～6天时向培养基中添加不同浓度的牛蒡子苷和茶碱,以不含牛蒡子苷和茶碱的培养基为阴性对照,继续培养24 h,采用HPLC、ELISA以及考马斯亮蓝法分别测定骨骼肌细胞cAMP PDE的活性、细胞内cAMP水平以及细胞总蛋白质合成。【结果】牛蒡子苷终浓度达到2.5 μg•ml-1、茶碱终浓度为20 μg•ml-1时均能极显著抑制原代培养骨骼肌细胞cAMP PDE的活性(P＜0.01）,显著提高细胞内cAMP水平（P＜0.05）,极显著促进肌细胞总蛋白质的合成（P＜0.01）。【结论】中药成分牛蒡子苷具有通过调节骨骼肌细胞内PDE的活性和cAMP水平,增加肌细胞蛋白质合成,促进骨骼肌细胞生长的作用。结果提示对PDE有抑制作用的中药有望成为促进动物生长的新型饲料添加剂。     

猪嗜中性粒细胞cAMP磷酸二酯酶的提取与活性检测

目的:提取动物体的cAMP磷酸二酯酶(PDE),并检测其活性,为兽医临床研究PDE活性的生理病理变化和中西药物对PDE活性调节作用建立实验方法。方法:猪血经过葡聚糖沉降,淋巴细胞分离液分离,特殊分离液洗涤和红细胞溶胀后,获得嗜中性白细胞。嗜中性白细胞破碎后释放PDE,通过反相高效液相色谱(RP HPLC)法测定反应体系中cAMP的含量,根据底物(cAMP)的减少量,确定嗜中性白细胞中PDE活性。结果:经显微镜计数嗜中性粒细胞纯度达95%;酶量在10～40μl间对cAMP的分解率为9 90%～31 39%,与PDE活性之间存在直线相关关系(r=0 99)。结论:猪嗜中性粒细胞中含有高纯度、高活性的cAMP PDE;高效液相色谱法可以准确测定PDE反应前后cAMP含量的变化;两种方法结合可以作为兽医临床研究机体PDE活性变化和中西药物对PDE活性调节作用的新方法。     

地稔凝集素的提取及凝血活性的研究

为研究和利用地稔的促凝血活性物质,以地稔为试材,提取地稔凝集素,研究pH、温度和糖等理化因素对凝血活性的影响。结果表明:经硫酸铵沉淀及透析提取的地稔凝集素具有红细胞凝集活性;碱性条件下,抑制作用明显,而酸性条件有较强促进作用;温度对凝集素凝血活性影响很小;半乳糖有明显促进作用。     

犬中枢神经不同部位磷酸二酯酶基因表达和活性测定

为探明磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)在犬中枢神经活动中的作用,采用反转录聚合酶链反应检测18个PDE亚型在犬中枢神经不同部位中(大脑、小脑、延髓和脊髓各段)的表达分布,以高效液相色谱法检测环核苷酸在酶反应前后的含量变化,计算PDE活性。结果显示:在所测18个PDE亚型中,犬中枢神经的8个测定部位均有PDE1A,PDE1B,PDE1C,PDE2A,PDE3A,PDE3B,PDE4A,PDE4B,PDE4C,PDE4D,PDE5A,PDE7A,PDE7B,PDE8A,PDE8B,PDE9A,PDE11A表达,PDE10A均呈阴性表达,不同部位之间表达量差异较大,其中PDE4在各部位均呈优势表达;8个测定部位cAMP-PDE活性均高于cGMP-PDE活性,且不同部位PDE活性存在差异,其中脑组织cAMP-PDE活性和cGMP-PDE活性均高于脊髓各段。结果提示PDE可能在由cAMP和cGMP介导的中枢神经经信号传导中发挥着重要作用。     

四味中草药体外抗菌作用研究

[目的]通过黄连、黄柏、地榆、五味子4味中草药对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、炭疽杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌6株细菌的抗菌试验,比较不同药物活性大小。[方法]采用水煎法提取中药有效成分,然后采用改进K-B纸片琼脂扩散法测定抑菌圈直径,并用试管稀释法测定最小抑菌浓度。[结果]4味中草药均明显抑制金黄色葡萄球菌,炭疽杆菌、志贺氏菌次之;对其余3种细菌仅部分药物有一定的抑菌活性。[结论]4味中草药具有抗菌作用。     

三种中药提取物对桃褐腐菌（Monilinia fructicola）的抑菌作用

为筛选出对桃褐腐病菌具有抑制作用的中草药抑菌活性物质,采用三次浸渍提取法对中草药进行提取,通过菌丝生长速率法、单位面积产孢量计算法和凹玻片悬低法进行抑菌活性测定,再经过光学显微镜观察抑菌活性物质对桃褐腐菌的形态、结构的破坏作用,结果标明:黄芩、甘草和威灵仙的4种溶剂提取物对桃褐腐病菌(M.fructicola)均有不同程度的抑制作用,其中黄芩丙酮提取物和黄芩80%乙醇提取物的抑制作用较强,抑菌率达到80%以上,对菌丝细胞有明显的破坏作用,且能够抑制分生孢子的产生与萌发;同时对供试的16种植物病原真菌也有不同程度的抑制效果,抑菌谱较广.说明黄芩丙酮和黄芩80%的乙醇提取液中均含有抗菌成分.     

Influence of gallic acid on porcine neutrophils phosphodiesterase 4, IL-6, TNF-α and rat arthritis model

Our previous studies showed that the anti-inflammatory effects of Paeonia lactiflora roots extract may be mediated, at least in part, through its gallic acid content, and this effect may be regulated in part by an inhibition on cAMP-phosphodiesterase (PDE). To explore the anti-inflammatory effect and mechanism, the influence of gallic acid on neutrophils PDE4 activity and expression, TNF-α and IL-6 content and rat arthritis model were further studied. PDE4 activity and gene express were calculated respectively by substrate cAMP change examined with HPLC and real-time RT-PCR. The concentration of IL-6 and TNF-α in supernatant were assayed by ELISA method. Model of rat arthritis was caused by complete Freund’s adjuvant. Results showed that gallic acid had a dose-dependent restraint on PDE4 activity of neutrophils in vitro, promoted significantly PDE4A expression (P<0.01), and had no influence on the expressions of PDE4B and 4D. However, PDE4C expression was not detected. Gallic acid could promote IL-6 release (P<0.05), and inhibit TNF-α release of neutrophils (P<0.05). The experiment in vivo showed that gallic acid had obvious restraint on local inflammation of animal model (P<0.05). Therefore, the anti-inflammatory effect of gallic acid may be mediated in part through an inhibition on PDE4 activity and further an increase of IL-6 and a decrease of TNF-α of neutrophils, and this effect seemed to have no relationship with PDE4 expression.     

白芍制剂对中性粒细胞相关功能及磷酸二酯酶活性的影响

 【目的】以猪中性粒细胞为靶细胞,研究白芍制剂对其相关功能（呼吸爆发和弹性蛋白酶释放）及磷酸二酯酶活性的影响。【方法】中性粒细胞分离纯化后,以细胞色素C还原法检测中性粒细胞呼吸爆发,以弹性蛋白酶底物的减少反映弹性蛋白酶的释放量,以HPLC检测底物cAMP的变化反映磷酸二酯酶的活性等。【结果】白芍制剂呈剂量依赖性抑制中性粒细胞的呼吸爆发（P＜0.001）,3个不同浓度的抑制率分别为33.15%、45.96%和62.22%;对弹性蛋白酶的释放在低浓度时表现抑制作用（P＜0.05）,抑制率为23.22%,在高浓度时表现促进作用;对中性粒细胞磷酸二酯酶活性具有抑制作用,低、高浓度抑制率分别为13.24%和25.87%（P＜0.01）;HPLC指纹图谱分析表明白芍制剂主要存在5种成分。【结论】白芍制剂对猪中性粒细胞呼吸爆发具有明显的抑制作用,对弹性蛋白酶释放在低浓度有显著抑制作用,其作用机制可能与白芍制剂对磷酸二酯酶活性的抑制有关。     

Luteolin prevents f MLP-induced neutrophils adhesion via suppression of LFA-1 and phosphodiesterase 4 activity

Luteolin is an active ingredient found early from Folium perillae and Flos lonicerae, and has a specific inhibition on phosphodiesterase 4(PDE4) activity in vitro. Researches show luteolin has pharmacological effects of anti-inflammation, anti-anaphylaxis, antitumor, antioxidant, protection of nervous system and so on, and has mainly been used for the treatment of respiratory inflammatory diseases, cancer and cardiovascular disease in clinic. PDE4, specific to hydrolyze cyclic AMP(c AMP), is considered to be a new anti-inflammatory target due to the decisive role on c AMP signal in inflammatory cells such as neutrophils. In order to explore the anti-inflammatory mechanism, we further studied the effects of luteolin on the activity and expression of PDE4, the expression of lymphocyte function-associated antigen-1(LFA-1) and macrophage-1(MAC-1) in neutrophils, and the adhesion of neutrophils and endothelial cells. The results showed that luteolin had a dose-dependent inhibition on both bare PDE4 activity and PDE4 in cultured neutrophils, and had an obviously promotive effect on gene expressions of PDE4 A, 4B and 4D in later period. Luteolin had a significant inhibitory effect on neutrophils adhesion and LFA-1 expression in early stage, and had no obvious effect on MAC-1 expression. Therefore, luteolin can inhibit LFA-1 expression of neutrophils, then inhibit the adhesion of neutrophils and endothelial cells, and the mechanism is at least related with the inhibition of PDE4 activity.     

DISC1 and PDE4B are interacting genetic factors in schizophrenia that regulate cAMP signaling

The disrupted in schizophrenia 1 (DISC1) gene is a candidate susceptibility factor for schizophrenia, but its mechanistic role in the disorder is unknown. Here we report that the gene encoding phosphodiesterase 4B (PDE4B) is disrupted by a balanced translocation in a subject diagnosed with schizophrenia and a relative with chronic psychiatric illness. The PDEs inactivate adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP), a second messenger implicated in learning, memory, and mood. We show that DISC1 interacts with the UCR2 domain of PDE4B and that elevation of cellular cAMP leads to dissociation of PDE4B from DISC1 and an increase in PDE4B activity. We propose a mechanistic model whereby DISC1 sequesters PDE4B in resting cells and releases it in an activated state in response to elevated cAMP.     

牛蒡子与牛蒡子苷对小鼠骨骼肌cAMP及其磷酸二酯酶活性和生长性能的影响

 【目的】观察中药牛蒡子及其主要成分牛蒡子苷对小鼠骨骼肌cAMP磷酸二酯酶(cAMP PDE)活性和cAMP含量、血浆cAMP含量与生长性能的影响,探讨促进动物生长的作用及机理。【方法】断奶ICR小鼠分别灌服不同剂量的牛蒡子煎剂：1.00、0.50、0.25 g/只,牛蒡子苷溶液：1.50、0.75、0.38 mg/只和阳性对照茶碱溶液：0.75、0.38、0.19 mg/只。记录体重和采食量,采用HPLC和ELISA法分别测定骨骼肌组织cAMP PDE活性和血浆cAMP含量。【结果】1.00 g和0.50 g的牛蒡子煎剂和3个剂量的牛蒡子苷显著或极显著降低采食量;除0.38 mg的牛蒡子苷外,各剂量给药组都显著或极显著促进增重;各剂量的牛蒡子、牛蒡子苷和茶碱都极显著提高饲料转化率(P＜0.05,P＜0.01,或P＜0.001)。各剂量的牛蒡子、牛蒡子苷和茶碱都显著或极显著抑制cAMP PDE活性;除1.5 mg的牛蒡子苷外,都显著或极显著提高骨骼肌组织cAMP含量,除0.75 mg茶碱外,都显著或极显著提高血浆cAMP含量(P＜0.05,P＜0.01,或P＜0.001)。骨骼肌cAMP含量与cAMP PDE活性呈极显著负相关,r = -0.402(P＜0.001),血浆cAMP含量与骨骼肌cAMP含量呈极显著正相关性,r =0.553(P＜0.001),与cAMP PDE活性呈负相关,r =-0.436(P＞0.05)。【结论】牛蒡子和牛蒡子苷通过抑制骨骼肌cAMP PDE活性,提高骨骼肌和血浆cAMP水平,提高动物生长性能。     

胡黄连与牛蒡子有效成分对猪磷酸二酯酶7A2活性的影响

从牛蒡子、胡黄连中筛选对猪磷酸二酯酶（PDE） 7A2具有抑制作用的中药单体成分,为PDE亚型抑制剂研究积累资料.使用高效液相色谱法（HPLC）测定绿原酸、牛蒡子苷、β-谷甾醇和胡黄连苷-Ⅱ对体外原核表达的猪PDE7A2的抑制作用.结果表明：在反应质量浓度为1,5,10,50,100 μmol/L时,绿原酸对猪PDE7A2的活性抑制率分别为12.55％,46.29％,56.17％,68.52％,47.12％;牛蒡子苷抑制率分别为21.60％,41.35％,70.16％,88.27％,80.07％;β-谷甾醇抑制率分别为40.53％,54.52％,71.81％,96.50％,94.86％;胡黄连苷-Ⅱ抑制率分别为69.34％,94.03％,96.50％,103.09％,101.44％.绿原酸、牛蒡子苷、β-谷甾醇和胡黄连苷-Ⅱ对体外表达的猪PDE7A2均有抑制作用,其中胡黄连苷-Ⅱ对猪PDE7A2的抑制作用最强.