柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

柑橘愈伤组织RNAi沉默CCD1基因对其类胡萝卜素积累的影响

类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）可催化类胡萝卜素在特定位点氧化裂解生成多种生物活性化合物，其活性差异一定程度上决定了植物体内类胡萝卜素含量和组成变化。为了探讨柑橘中CCD1蛋白对类胡萝卜素积累的影响，从红肉脐橙（Citrus sinensis L. Osbeck）果实中克隆了CCD1 基因，将其特异片段通过重组反应连接到pHGRV 载体中，构建CCD1 的RNA 干扰载体pHGRV-CCD1。利用农杆菌介导的方法将其转入‘国庆1 号’蜜柑、‘伏令夏橙’和‘马叙’葡萄柚愈伤组织中，经PCR 鉴定分别获得6、4、4 个转基因干扰系。3 种柑橘材料转基因干扰系中CCD1 基因的表达水平均较野生型显著下调，其中‘马叙’葡萄柚转基因干扰系Rm2 的表达水平仅为野生型的8.4%，干扰效果最佳。CCD1 转基因干扰系愈伤组织外观多数呈现与野生型对照相近的色泽，仅Rm2 系可见较为明显的颜色变化；综合分析3种柑橘材料转基因前后类胡萝卜素含量变化，发现CCD1 基因抑制表达后，紫黄质、9–顺式–紫黄质的含量均较野生型显著增加，表明其可能是CCD1 在柑橘愈伤组织体内优先选择的裂解底物。     

黄龙病菌胁迫下‘锦橙’CsCalS5表达和胼胝质沉积的初步分析

胼胝质合成酶是控制胼胝质合成的关键酶,在植物生长发育和抗逆胁迫中具有重要作用。克隆并分析‘锦橙’胼胝质合成酶基因CsCalS5及其启动子序列,实时荧光定量PCR检测CsCalS5的组织表达模式以及植物生长调节剂、黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的诱导表达模式,并通过组织切片观察感染黄龙病和柑橘溃疡病‘锦橙’叶脉胼胝质的沉积。结果显示,CsCalS5启动子序列中含有脱落酸和病原菌的响应元件;CsCalS5编码1952个氨基酸含有保守结构域FKS1和β-1,3-葡聚糖合成酶功能域的跨膜蛋白;CsCalS5在‘锦橙’的茎中高表达,且受脱落酸的诱导;黄龙病菌侵染后叶脉韧皮部的胼胝质沉积明显,患病叶片CsCalS5的表达量是健康对照的4.02倍;柑橘溃疡病菌侵染叶片后,叶脉韧皮部胼胝质沉积无明显增加,且CsCalS5的表达量与健康对照无显著差异。综上,黄龙病菌可能通过上调‘锦橙’CsCalS5的表达促进韧皮部胼胝质的沉积,从而增强其防御能力,且这种抗性可能受到脱落酸的调控。     

过氧化氢酶基因CsKat01与柑橘溃疡病相关性分析

为了探究过氧化氢酶基因Cs Kat01在柑橘抵御溃疡病过程中的作用,对感病品种‘晚锦橙’和抗病品种‘四季橘’中Cs Kat01进行了生物信息和表达分析,并探究了溃疡病菌接种处理后两品种中CAT酶活性和H2O2含量的关系。克隆Cs Kat01的编码序列并对该基因及其编码蛋白进行结构和功能分析,发现Cs Kat01编码框全长为1482bp,共编码493个氨基酸残基,蛋白序列中含有典型的CAT结构域;通过启动子序列克隆和分析发现‘晚锦橙’和‘四季橘’核心启动子区域均含有水杨酸、茉莉酸和脱落酸的响应元件,但数量不同;利用q RT-PCR分析水杨酸、茉莉酸、脱落酸和柑橘溃疡病菌(Xcc)对Cs Kat01的诱导表达特性,发现Cs Kat01的高表达可能使柑橘相对更感病;结合Xcc诱导后植物组织中Cs Kat01酶活性和H2O2含量,综合分析Cs Kat01、CAT酶活、H2O2含量和柑橘对溃疡病抗性之间的关系,推测Cs Kat01基因可能通过调控CAT的酶活性,改变H2O2含量进而影响柑橘对溃疡病的抗性。     

桂花OfNCED3调控转基因烟草叶片类胡萝卜素和叶绿素的合成

从桂花（Osmanthus fragrans）‘堰虹桂’转录组数据库中筛选获得OfNCED3基因序列。氨基酸序列分析发现OfNCED3具有NCED家族特有的2个保守结构域MIAHPKxDP和HDFAITE以及4个保守的组氨酸残基。进化树分析发现OfNCED3与番茄SlNCED1聚为一支。实时荧光定量PCR结果表明，桂花开放过程中，Of NCED3在类胡萝卜素含量较高的‘堰虹桂’花瓣中的表达量显著低于类胡萝卜素含量较低的‘玉玲珑’，推测OfNCED3可能与‘堰虹桂’和‘玉玲珑’花瓣中类胡萝卜素含量差异有关。通过农杆菌介导的遗传转化方法获得过表达OfNCED3烟草株系。利用分光光度计和超高效液相（ultra high performance liquid chromatography,UPLC）测定叶绿素、类胡萝卜素和ABA的含量，并采用实时荧光定量PCR分析类胡萝卜素通路上相关基因的表达差异，结果发现异源过表达Of NCED3导致转基因烟草叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量下降，ABA含量增加，类胡萝卜素合成基因的表达量明显上调，且下游合成基因上调幅度高于上游合成基因。本研究表明Of NCED...     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因，分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征，通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明，CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp，编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达，而在低感品种四季橘中上调表达；在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达，而晚锦橙中上调幅度较小；两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显；超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株；抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）；转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高；水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述，CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因，它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

柑橘溃疡病菌分化及防治研究进展

对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)的分类地位、菌系分化和致病机理进行了总结,重点阐述了运用生物学、血清学和分子生物学方法鉴定溃疡病菌遗传变异的研究进展,并介绍了该病的防治方法。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

分泌型Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平

 为了利用Cecropin B（CB）抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信 号肽的Cecropin B 抗菌肽基因PR1aCB 和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB 抗菌肽 相比,PR1aCB 和AATCB 抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了CaMV 35S 调控 PR1aCB 和AATCB 基因的植物表达载体,转化塔罗科血橙（Citrus sinensis Osbeck）上胚轴,获得转基因植株。GUS 组织化 学染色、PCR 和Southern blot 分析表明外源基因已成功整合入柑橘基因组。Real-time PCR 定量分析表明, 抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明,转PR1aCB 和AATCB 基因植株的抗 性显著强于非转基因植株,其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’ （C. madurensis）相当。