小麦种子萌发基因TaJAZ1的克隆和功能研究

小麦品种铭贤169是我国黄淮麦区育种研究广泛应用的条锈病诱发材料,但其种子休眠时间过长,不仅影响播种后均匀发芽和生长发育,其收获掉落籽粒也容易导致秋季育种田的生物学混杂。本研究通过筛选其休眠种子与萌发种子的转录组学数据,克隆获得差异表达基因TaJAZ1,并对其生物信息学特性、亚细胞定位、表达模式进行分析,结合解析拟南芥jaz3（与TaJAZ1同源性最高）突变体、TaJAZ1过表达拟南芥和水稻的表型反应。结果表明,TaJAZ1基因编码区全长1 230 bp,可编码409个氨基酸,在不同物种间保守性较强,与野生二粒小麦JAZ1基因的亲缘关系最近;启动子区含有脱落酸响应元件ABRE 和茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif;该基因定位于细胞核和细胞膜,TaJAZ1基因在种子发育中穗发芽时期表达量达到最高,进入成熟时期表达量显著降低;ABA能诱导TaJAZ1基因的表达,ABA处理下过表达拟南芥的萌发率比野生型和jaz3突变体高,ABA信号通路基因AtABI5的诱导量变低;TaJAZ1过表达水稻的萌发率高于受体水稻, ABA处理后,OsABI5的诱导量也降低。以上结果证明,TaJAZ1基因能促进种子萌发,进一步验证其在ABA信号通路中起负调控作用,为改良铭贤169等强休眠性小麦品种提供参考。     

小麦果糖激酶基因TaFRK与TaPFT的互作分析

小麦赤霉病是全球性病害,严重威胁着中国的小麦粮食安全。目前已经明确的抗赤霉病位点有7个（ Fhb1~ Fhb7）。 其中 Fhb1位点是3BS染色体上稳定性和效应最大的抗扩展位点。 TaPFT是 Fhb1位点上的抗性基因之一,但其抗性机理并不清楚。本研究以TaFRK为诱饵蛋白通过酵母双杂交技术筛选小麦酵母双杂交文库,从而得到互作基因 TaFRK,其编码蛋白为果糖激酶。进一步通过构建酵母双杂交载体和双分子荧光互补载体分析 TaFRK与 TaPFT之间的互作关系,并通过qPCR分析 TaFRK受到禾谷镰刀菌孢子诱导后的表达模式。通过酵母双杂交试验发现,共转pGBKT7 - TaPFT和pGADT7 - TaFRK 的酵母菌株Y2HGlod在含有X-α-Gal和金担子素A（Aureobasidin A,AbA）的四缺培养基SD/-His-Leu-Trp-Ade上长出蓝色菌落,证明 TaFRK与 TaPFT在酵母中互作。通过双分子荧光互补试验发现,在共转YN- TaPFT和YC- TaFRK表达载体的烟草叶片中可观察到强烈的黄色荧光信号,表明 TaFRK与 TaPFT在植物细胞中能够发生相互作用。实时荧光定量PCR分析发现,禾谷镰刀菌孢子侵染抗性小麦后, TaFRK基因表达量升高,说明 TaFRK基因的表达受禾谷镰刀菌侵染诱导。本研究结果对进一步研究 TaPFT的赤霉病抗性机制具有一定的参考  价值。     

小麦 DA1基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

泛素受体DA1在控制种子和器官大小上发挥着重要作用。本研究以中国春小麦为材料,采用生物信息学的方法对小麦 DA1基因家族成员进行了全基因组鉴定和分析,共鉴定到12个小麦 DA1同源基因（ TaDA1s）,分别位于2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色体上,亚细胞定位预测结果表明其位于细胞核中。系统进化分析发现, TaDA1s可分为 TaDA1、 TaDAR1和 TaDAR2三类。除TaDA1-2D1编码的蛋白只含有DA1-like结构域外,其他成员编码的蛋白均含有DA1-like、UIM和LIM结构域。启动子序列分析发现, TaDA1s的启动子区含有较多的响应激素、逆境以及与生长发育相关的顺式作用元件。通过公共的转录组数据和qRT-PCR试验验证, 发现 TaDA1s在不同组织中都有表达,在籽粒发育过程中,不同的小麦 DA1基因呈现不同的表达模式,暗示存在基因功能分化现象;脱落酸（ABA）能够抑制 TaDA1s的表达;在低温和盐胁迫条件下, TaDA1s基因表达有明显的差异。酵母双杂交和荧光素酶互补试验发现,TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2存在转录自激活现象,且TaDAR1-5A与TaGW2有微弱的互作效应。本研究结果为进一步探究 DA1基因家族在小麦中的生物学功能奠定了基础。     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

大豆GmWRKY52生物信息学分析及与GmNF-YA13互作研究

WRKY转录因子在植物生长发育及逆境调控过程发挥着重要作用。前期通过酵母双杂交筛选干旱处理后的大豆cDNA文库时发现GmWRKY52(NP＿001237726.2)可能与GmNF-YA13蛋白存在互作，为明确二者是否存在互作，本研究克隆GmWRKY52基因并进行生物信息学分析，利用酵母双杂交系统鉴定GmWRKY52和GmNF-YA13之间的互作关系。结果显示：GmWRKY52基因全长1 163 bp,编码1个由265个氨基酸组成的蛋白质，多序列比对和系统发育树分析结果说明GmWRKY52基因与野生大豆GsWRKY69(XP＿028186817.1)亲缘关系较近。酵母双杂交结果表明GmWRKY52和GmNF-YA13蛋白不存在相互作用。研究结果说明GmWRKY52与GmNF-YA13蛋白在酵母细胞内并不发生互作。     

寒地冬小麦TaEXPB12同源基因在拟南芥中的遗传转化及功能分析

扩展蛋白（Expansin）是一类具有非水解活性的细胞壁松弛蛋白,参与调控植物的生长发育和胁迫抗性。为探究寒地冬小麦扩展蛋白基因TaEXPB12-A/B/D的功能,本研究将克隆自高抗寒冬小麦品种东农冬麦2号的TaEXPB12-A/B/D三个基因转化到拟南芥中,利用抗性筛选、PCR和Western-blot鉴定,分别获得了过表达TaEXPB12-A/B/D三个基因的转基因拟南芥植株。进一步对转基因拟南芥的生长情况进行观察,并测定低温胁迫下转基因拟南芥的存活率、体内抗氧化酶活性以及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖的含量。结果显示,过表达TaEXPB12-A/B/D三个基因可促进拟南芥根的伸长以及根毛和侧根的生长,且转基因拟南芥的叶宽、叶片数目、株高均显著高于野生型;低温处理后转基因拟南芥体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性以及可溶性糖、Pro的含量均维持在较高水平,且MDA的含量较低。以上结果表明,TaEXPB12-A/B/D三个基因的过表达显著促进了转基因拟南芥的生长,并提高了转基因植株在低温胁迫下的存活率。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应,其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因,氨基酸序列比对分析发现,该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高,亲缘关系较近;ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导;在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明, ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

橡胶树乳管HbPMP1基因的克隆与表达分析

过氧化物酶体膜蛋白PMP是ABC转运蛋白ABCD亚家族蛋白之一,存在于过氧化物酶体膜上。研究表明,拟南芥中的ABCD亚家族ABC转运蛋白AtABCD1主要通过参与部分物质运输进入过氧化物酶体,其中包括茉莉酸合成的前体 OPDA。本研究通过RACE技术克隆了一个ABCD亚家族ABC转运蛋白基因HbPMP1,并进行表达分析。结果表明：HbPMP1全长4 011 bp,编码1 337个氨基酸残基,其表达产物与拟南芥AtABCD1有较高的相似性(氨基酸一致性为78%);该基因在伤害及外源茉莉酸诱导下     

甘蓝型油菜热激蛋白Bnp23相互作用蛋白的筛选和鉴定

以甘蓝型油菜热激蛋白p23（Brassica napus hsp23, Bnp23）为诱饵蛋白,用酵母双杂交LexA系统筛选拟南芥幼苗的AD-cDNA（activator domain-cDNA）文库,分离了39个酵母双杂交阳性克隆,其中两个阳性克隆的cDNA片段均编码拟南芥黑芥子酶结合蛋白（Arabidopsis thaliana PYK10 结合蛋白1,AtPBP1）。Blastp搜索到油菜黑芥子酶结合蛋白BnMBP6与拟南芥PBP1同源。经体外实验进一步证实AtPBP1和Bnp23之间存在相互作用。酵母双杂交实验也证实Bnp23能够与BnMBP6相互作用。     

甘肃小麦品种（系）面筋强度和糯蛋白基因分布规律研究

高分子量麦谷蛋白、 1B/1R易位系和糯蛋白基因是影响小麦面包、面条和馒头加工品质的重要因素。为明确甘肃省小麦品种（系）品质状况,用 Dx 5、 By8、 By9、Bx7^OE、 1B/1R、Wx等基因的特异性分子标记鉴定其对应基因在甘肃4个麦区298份小麦材料中的存在状况。结果表明,甘肃省小麦品种（系）中被检测基因分布频率在不同生态区域存在一定差异,从西部到东南部, Dx 5、 By8、Bx7^OE、 Wx-B 1b基因的检出频率逐渐降低,而 By9基因和1B/1R易位系检出频率逐渐升高;春小麦中 Dx 5（46.4%）、 By8（26.1%）、Bx7^OE（1.4%）、 Wx-B 1b（14.4%）基因的检出频率明显高于冬小麦中 Dx 5（26.3%）、 By8（25.0%）、Bx7^OE（0）、 Wx-B 1b（7.5%）基因的检出频率;但春小麦 By9（34.8%）基因、 1B/1R易位系（27.5%）检出频率低于冬小麦 By9（41.3%）、 1B/1R（38.8%）的被检出频率。面筋强度和糯蛋白基因的分布频率表明甘肃省小麦品种（系）用于加工面包、面条和馒头的品质状况较差,且从西部到东南部品质逐渐变劣,春小麦品质优于冬小麦。甘肃省大部分小麦品种（系）仅适宜于加工普通馒头和面条。     

粗山羊草JAZ基因家族的全基因组鉴定与分析

为了挖掘可用于小麦茉莉酸调控通路及其穗部或花器官发育研究的候选基因,基于已发布的粗山羊草全基因组数据,利用生物信息学分析方法鉴定了粗山羊草JAZ基因家族,并从染色体分布、基因及蛋白结构、启动子顺式作用元件、系统进化关系和基因表达模式等方面对该基因家族的特征进行了比较分析。结果表明,本研究共鉴定到9个粗山羊JAZ基因,命名为AetJAZ1-AetJAZ9。染色体定位结果显示,9个粗山羊草JAZ基因分别定位在2D、5D、6D和7D染色体上,其中在7D染色体上分布最多。进化分析表明,粗山羊草JAZ蛋白与短柄草JAZ蛋白亲缘关系最近,且9个粗山羊草JAZ蛋白被分别聚类到了S5、S12、S13、S16和S20五个亚族中,其中S20亚族有五个粗山羊草JAZ蛋白。启动子分析表明,9个粗山羊草JAZ基因启动子顺式作用元件种类和数量存在差异,推测其各自的功能也存在差异。表达谱分析表明,粗山羊草JAZ基因在粗山羊草不同组织间存在不同的表达特性,且不存在组成型表达基因,其中,AetJAZ1和AetJAZ2表现出明显的组织特异性,分别只在穗部、雌蕊和雄蕊中特异表达。     

用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。     

冬小麦miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因CSD1表达的调控

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA,其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD),使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下miR398的调控机制,从东农冬麦1号中克隆小麦miR398前体,构建过表达载体并转化拟南芥,用Real-time PCR检测T0代植株中小麦miR398及其靶基因CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明,随着低温胁迫时间的延长,miR398表达下调、CSD1基因表达上调,认为小麦miR398能响应低温胁迫、负调控CSD1基因表达,间接提高了拟南芥的抗寒性。     

小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1 1A转录活性检测及互作蛋白筛选

为了进一步解析小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A的调控机制，本研究对其进行了自激活性检测。利用已构建好的小麦酵母cDNA文库，以TaNRT1.1-1A为诱饵，通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白，回转试验进一步验证其互作关系。结果表明，TaNRT1.1-1A无自激活活性，酵母双杂技术筛选小麦cDNA文库，共获得2个候选互作蛋白，候选蛋白Sdr I-like主要参与植物病害有关的应答响应。Sdr I-like的回转验证结果表明，该蛋白可能与TaNRT1.1-1A存在互作关系。该结果可为进一步研究TaNRT1.1-1A调控小麦硝酸盐吸收有关的分子机制奠定基础。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

小麦冷休克蛋白基因TaCSP的克隆及表达分析

为深入研究小麦冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)基因,根据大肠杆菌(E.coli)CSPs蛋白保守氨基酸序列,借助生物信息学技术检索小麦EST序列,采用同源序列法拼接了小麦3个冷休克蛋白基因,并以小麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR对其进行扩增;同时,采用荧光定量PCR对3个基因的组织表达特性以及ABA、低温、高温、干旱和盐胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果表明,小麦3个冷休克蛋白基因TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3全长分别为290、374和377bp,各编码69、69、80个氨基酸残基。序列分析表明,TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3之间氨基酸相似性为72.9%~84.3%,与大肠杆菌来源CSPs的相似性为40.0%~79.7%。荧光定量PCR表达谱分析显示,TaCSPs在抽穗期小麦的根、茎、叶和幼穗中均能表达。胁迫分析表明,3个冷休克蛋白基因在小麦幼根中的表达,在低温和ABA处理下,表现为早期诱导、后期抑制,在高温、干旱和盐胁迫下,则表现为早期抑制、后期有所恢复。克隆获得的小麦3个冷休克蛋白基因在根组织中强烈表达,并受ABA和冷胁迫诱导,推测其在小麦抵御逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

白粉病菌侵染条件下小麦酵母双杂交文库的构建及可用性检测

为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400～2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。     

小麦PHO基因家族全基因组鉴定及表达分析

PHO基因家族主要参与磷酸盐的转运,在植物生长发育中起重要作用。为研究小麦PHO基因家族成员的潜在功能,本研究从小麦全基因组中鉴定PHO基因家族成员,并利用生物信息学手段对其基因结构特征、蛋白结构域、系统进化、顺式作用元件及表达特性进行分析。结果在小麦全基因组中共鉴定到12个PHO基因家族成员,所有成员均含有SPX和EXS结构域。系统进化、保守结构域和基因结构分析发现,小麦PHO蛋白与拟南芥PHO1-H1蛋白以及水稻PHO1蛋白亲缘关系较近;除TaPHO7、TaPHO10、TaPHO11和TaPHO12蛋白缺少部分基序外,其余小麦PHO蛋白均具有完整基序,且同一亚组内的成员具有相似的蛋白保守结构域和基因结构,说明PHO亚家族成员间高度保守。顺式作用元件分析发现,小麦PHO基因启动子区域含有与磷调控相关的激素诱导、光响应、低温响应等元件。基于RNA＿seq数据的组织特异性分析发现,大部分PHO基因在根中的表达量较高。qRT-PCR分析发现,低磷胁迫处理下磷高效小麦品种小偃54地下部分(根) TaPHO7和 TaPHO8基因的表达量显著高于对照。     

Wx-1基因变异和优质HMW-GS组合对中筋小麦品质的影响

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和Wx蛋白是两个影响小麦理化品质和制成品品质的重要因素。为研究HMW-GS和Wx基因变异对小麦理化品质、面条感官评分和质构特性的影响,以镇麦9号和扬糯麦1号为亲本的2个高代系为试验材料,研究了优质HMW-GS 5+10及Wx基因缺失对小麦理化品质及面条加工品质的效应。结果表明,品系1与品系2的湿面筋含量和SDS沉淀值与镇麦9号相近,但显著好于扬糯麦1号。相较于镇麦9号,品系1与品系2的直链淀粉含量分别降低了1.5%和2.5%,其峰值黏度和稀懈值均显著高于镇麦9号,膨胀势也高于镇麦9号。5+10亚基显著提高了面条质构参数中的硬度和咀嚼性,而Wx基因缺失显著提高了面条的软硬度评分和光滑性评分。综合来看,具有5+10亚基和 Wx-D1缺失型的品系2具有较高的SDS沉淀值、面团形成时间和稳定时间、较低的直链淀粉含量、较高的峰值黏度、稀懈值和膨胀势,蛋白质和淀粉综合品质表现较好。品系2面条总评分最高,显著高于镇麦9号和扬糯麦1号,其主要体现在适中的面条软硬度和较好的光滑性。推测Wx基因缺失和优质HMW-GS聚合可显著提高小麦淀粉品质和蛋白质品质,有效改善面条的蒸煮品质和感官评分。