荷斯坦奶牛抗热应激SCAR标记的研究与应用

为能利用抗热应激SCAR标记应用于奶牛抗热应激新品种的选育,随机选取52头高产耐热荷斯坦奶牛和41头高产不耐热荷斯坦奶牛,利用RAPD技术对筛选出的耐热分子标记进行序列分析和SCAR转化,并以S441 SCAR标记对种公牛和核心群的母牛进行检测和分析。结果表明,随机引物S441和S463在高产耐热组中分别扩增了581 bp和680 bp的特异性片段,序列比较显示,前者与KCNN2基因的同源性达90%,后者与NW_001024067.1|BtUn_WGA9442_2同源性达99%;S441 SCAR标记在种牛的检出率为:母牛12.7%[27/213],公牛32.6%[15/46];数据统计分析表明:有无S441 SCAR标记的母牛产奶量差异不显著(P>0.05),但在热应激条件下产奶量下降率差异极显著(P<0.01)。研究初步确定S441标记作为荷斯坦奶牛抗热应激分子标记。     

荷斯坦牛抗热应激分子标记S463的检测

本试验以S463为奶牛假定抗热应激的RAPD分子标记,在核心母牛场湖南省奶牛原种场测定不同世代的种母牛213头,在核心公牛场湖南省种公牛站,以及北京、上海、南京、安徽等地测定种公牛46头,共检测出具有S463分子标记的母牛26头,检出率为12.2%(26/213),公牛10头,检出率为21.7%(10/46).在湖南省奶牛原种场,有、无抗热应激分子标记的母牛在热应激期间的产奶量分别为1 724.53kg和1 531.62kg,产奶量下降率分别为3.47%和23.18%,产奶量差异不显著(P>0.05),但产奶量下降率差异显著(P<0.05),基本肯定了抗热应激分子标记在不同耐热牛群中的特异性.     

荷斯坦牛耐热性RAPD和SCAR标记的研究

以52头高产耐热组和41头高产不耐热组中国荷斯坦牛的DNA为材料,选用200条RAPD引物,利用RAPD-PCR技术,对荷斯坦牛的耐热性进行研究。结果发现,使用S441引物和S463引物在高产耐热组中分别发现了581 bp（RAPD-S441标记）和680 bp（RAPD-S463标记）2条特异性片段。通过测序和序列比较显示：581 bp的片段与KCNN2基因的同源性达90%;680 bp片段与NW_001024067.1｜BtUn_WGA9442_2的同源性达99%。根据已知KCNN2基因的功能,初步判断KCNN2基因为影响耐热性能的候选基因。得到GenBank登录号EF123743和EF123744。利用NCBI的ORF finder在581 bp中没有发现ORF,与预测其是KCNN2基因内含子3的结论相符合。在680 bp中发现4个开放阅读框（ORF）,分别为ORF1、ORF2、ORF3、ORF4。这4个阅读框分别编码48AA、34AA、45AA、34AA。根据RAPD-S441、RAPD-S463标记的测序结果,利用Premier 5.0软件设计对应的SCAR引物。成功将RAPD-S441标记转化为耐热SCAR标记。     

利用BLUP法估计荷斯坦种公牛的抗热应激育种值

以公牛女儿数大于10头为限制因子，建立线性模型Y=xb＋za＋e，对带有抗热应激$441标记的荷斯坦种公牛育种值进行了估计。结果表明：带有抗热应激S441标记的荷斯坦种公牛的平均育种值大于没有标记的群体均值。$441可以作为一种荷斯坦种公牛抗热应激分子标记应用于品种选育和生产中。应用CNDHI软件评估了2007～2011年公牛的最佳线性无偏差预测值，并依据年度均值作出遗传趋势，为选种和遗传评估提供依据。     

荷斯坦牛抗热应激候选基因S441的检测

本试验以S441为奶牛假定抗热应激候选基因。在核心母牛场湖南省奶牛原种场测定不同世代的种母牛213头,在核心公牛场湖南省种公牛站,以及北京、上海、南京、安徽等地测定种公牛46头,共检测出具有S441基因的母牛27头,检出率为12．7％（27／213）,公牛15头,检出率为32．6％（15／46）。在湖南省奶牛原种场,有、无抗热应激候选基因的母牛在热应激期间的产奶量分别为1736．75kg和1528．63kg,产奶量下降率分别为3．51％和22．56％,产奶量差异不显著（P〉0．05）,但产奶量下降率差异显著（P〈0．05）,基本肯定该基因为抗热应激候选基因。     

奶牛夏季产奶量与红细胞钾和S441遗传标记的研究

[目的]为探讨奶牛产奶量与红细胞钾含量和S441遗传标记是否存在联系.[方法]本研究以6～8月产奶量为依据将奶牛分为高产耐热组、中产组和低产不耐热组,采用原子吸收分光光度法测定红细胞钾含量,采用SCAR技术对S441遗传标记进行检测.[结果]表明:高产耐热组奶牛红细胞钾含量最低,90%有S441标记;中产组奶牛红细胞钾含量居中,40%有S441标记,低产不耐热组奶牛红细胞钾含量最高,10%有S441标记.[结论]初步得出奶牛耐热性能与红细胞钾含量呈一定的负相关,与S441遗传标记的有无存在正相关趋势.     

用RAPD技术筛选中国荷斯坦牛产奶量性状遗传标记

选用320条10碱基随机引物在由36头高产（305d产奶量〉8500kg）和32头低产（305d产奶量〈5600kg）中国荷斯坦牛所组成的2个DNA池间进行RAPD-PCR扩增，从中筛选出稳定性好、带型清晰且在2个DNA池间有明显差异的RAPD引物24条。用筛选到的24条引物对所有个体进行PCR检测，得到了5个与奶牛产奶量性状相关的RAPD标记，并对其中4个进行了克隆测序和SCAR标记转化以及生物信息学分析。结果表明：SCAR标记yield—s139与产奶量密切相关，应用电子克隆方法已将该标记由921bp延伸到2141bp，经同源性比较发现，此标记对应于奶牛基因组中LINEs家族中的一个重复元件，推测该元件附近可能存在与产奶量性状相关的QTLs或主效基因。     

荷斯坦奶牛耐热性状的RAPD标记研究

为了筛选出耐热荷斯坦奶牛的分子遗传标记，并应用这些分子标记进行高产耐热荷斯坦奶牛的选育。从高产奶牛群中筛选出耐热性状差异显著的10头高产荷斯坦牛作为实验材料，采用RAPD作为分子标记筛选方法。优化奶牛RAPD反应最佳体系，并在154条随机引物中筛选出稳定性好、带型清晰的引物64条。通过RAPD结果，并结合红细胞钾测定结果和生产性能进行分析，确定3个分子标记与奶牛耐热性状相关，并对其进行了测序与分析。     

荷斯坦奶牛耐热性标记的检测

通过对67头中国荷斯坦奶牛在热应激条件下产奶量下降幅度的分析,得出其个体差异较大。并以产奶量下降幅度大小为依据,按胎次、分娩日期、产奶量相近原则分为耐热组和不耐热组,每组6头,测定两组牛在非热应激期的日平均直肠温度、血红蛋白值和红细胞钾浓度。结果表明:红细胞钾浓度在两组牛中存在显著差异(p<0.05),可作为中国荷斯坦奶牛耐热性的评定标记。     

荷斯坦奶牛耐热分子遗传标记的研究

选取10头高产荷斯坦牛为实验材料,优化奶牛RAPD反应最佳体系,并在154条随机引物中筛选出稳定性好、带型清晰的引物64条。结合红细胞钾测定结果和生产性能测定,通过RAPD分析并筛选出3个与奶牛耐热性状相关的分子标记,以期应用这些分子标记进行高产耐热荷斯坦奶牛的选育。