转玉米PEPC和PPDK基因杨树苗期的光合生理特性

【目的】磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)是保证C4植物高效光合作用的关键酶。杨树作为光合效率较低的C3植物,其光能利用率低,本研究以玉米PEPC基因和PPDK基因分别作为目的基因进行杨树遗传转化,分别获得转基因的高效表达植株,并进行分子检测及相关功能分析,为培育杨树高光效新品种提供依据。【方法】通过生物信息学筛选玉米PEPC和PPDK基因。利用Gateway系统,将PEPC和PPDK基因分别构建到植物表达载体pGWB406,通过农杆菌介导法转化南林895杨。比较分析转基因植株与对照(南林895杨)的光合生理特性。【结果】筛选克隆的PEPC及PPDK基因均编码典型的C4光合作用关键酶。南林895杨转PEPC基因获得5个株系,不同株系间基因表达量具有差异,最大达1.79倍,但编码蛋白在不同株系叶片中的表达量无显著差异;转PPDK基因获得3个株系,各株系间基因及蛋白表达量无显著差异。PEPC和PPDK在叶片中的表达量均高于茎中,且随着植株生长发育而提高; PEPC和PPDK基因的表达均受光照条件的影响,在高光照下表达量上升2～3倍。转基因株系净光合速率在11:00—14:00出现双峰状态,且显著高于对照组,最高达16.2%(PEPC-5株系);气孔导度在12:00—16:00高于对照组;除PPDK-2株系外,转基因株系都检测到比对照组更高的胞间CO2浓度,除PEPC-1和PEPC-4株系外,转基因株系CO2饱和点均低于对照组;全部转基因株系CO2补偿点均低于对照组,且光饱和点以及在光饱和点的光合速率均高于对照组。生长参数方面,PEPC-3和PEPC-4株系多个指标显著优于对照组(P0.05),平均株高分别高于对照组5.6%和2.9%,叶面积分别高于对照组13.8%和8.9%,叶片质量分别高于对照组23.6%和19.8%,地径分别高于对照组13.5%和5.4%;转基因株系的茎生物量均高于对照组,叶生物量优势最为明显的依次是PEPC-3、PEPC-5和PEPC-4株系,分别高于对照组34.8%、15.4%和6.3%。【结论】玉米PEPC和PPDK基因导入南林895杨获得的转基因植株在强光利用方面具有明显的优势,植株的光合能力显著提高,生长指标优于对照组。利用C4植物的光合作用关键酶编码基因对杨树进行遗传转化,对于提高杨树甚至木本植物的光合效率具有重要意义。     

毛果杨Rubisco活化酶基因的克隆与功能分析

【目的】核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是参与植物光合作用的第1步碳同化的关键酶,而Rubisco活化酶(RCA)能够使Rubisco处于稳定的催化活性状态,从而提高光合效率。本研究从毛果杨中克隆RCA基因并通过遗传转化南林895杨,获得PtRCA高表达的转基因株系,并进行分子检测及相关功能分析,为培育杨树新型高光效抗逆品种提供依据。【方法】基于毛果杨基因组数据库信息克隆PtRCA基因序列,利用生物信息学对PtRCA基因进行功能和结构分析。采用Gateway技术将PtRCA构建到植物表达载体pGWB406中,以南林895杨为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化。以转PtRCA基因南林895杨和对照(南林895杨)为材料,测定分析在高温胁迫下转基因植株的基因表达、光合参数和叶绿素荧光参数的差异。【结果】从毛果杨中克隆获得PtRCA的CDS序列长1 323 bp,编码440个氨基酸残基,其蛋白相对分子质量为48 315.9 Da,等电点pI为5.57,为疏水性蛋白,无信号肽以及跨膜结构;通过序列对比,发现PtRCA属AAA+超级家族一员,且与大豆、拟南芥RCA蛋白同源性较高。转PtRCA基因南林895杨RCA表达量均高于对照,且能够利用强光充分进行光合作用,其光饱和点也均高于对照,增加约12.5%~37.5%;光补偿点除3号株系外,其他转基因株系均略低于对照;转基因植株在光饱和点的光合速率比对照增高24.6%~55.7%。转基因株系对CO_2的利用能力和羧化效率均强于对照组,CO_2饱和点除1号和4号株系外,其他株系均比对照低12.5%~25.0%;CO_2补偿点比对照降低53.1%~80.4%;光呼吸比对照低37.7%~79.3%,并且转基因杨树在CO_2饱和点的光合速率比对照增高4.4%~26.4%。另外,转基因杨树表现出耐光氧化的能力,光氧化处理后,对照PSⅡ原初光化学效率下降61.7%,而转基因杨树下降45.0%~53.1%;对照PSⅡ实际光化学效率下降54.1%,而转基因杨树下降38.7%~52.0%;光化学猝灭系数对照下降68.3%,而转基因杨树下降51.0%~65.8%;非光化学猝灭系数对照仅增加3.0%,而转基因杨树增加6.0%~26.5%。【结论】杨树Rubisco活化酶(PtRCA)蛋白与大豆、拟南芥RCA蛋白同源性较高。通过实时定量及相关生理分析表明,转PtRCA基因南林895杨具耐高温特性,利用CO_2和强光进行光合作用的能力较强,催化Ru BP进行羧化反应的效率较高。转PtRCA基因杨树能够充分利用吸收的光子,PSⅡ反应中心效率较高,过剩光能量得到较好的耗散,表现出耐光氧化的能力。研究结果表明,PtRCA基因的高效表达提高了转基因植株的光合效率,并对高温高光强具有调节能力。     

转Bt基因南林895杨对美国白蛾抗虫性研究

【目的】通过对转Bt基因南林895杨进行虫试测定,分析转基因植物对不同世代美国白蛾Hyphantria cunea的杀虫活性、转基因杨树抗虫效果的时空动态、转基因杨树对不同龄期美国白蛾的杀虫效果,以及对美国白蛾幼虫生长发育的影响,为转基因杨树的应用推广和美国白蛾防治提供相关依据。【方法】以实验室获得的转Bt(Cry1Ah1）基因南林895杨16个株系为材料,对美国白蛾幼虫进行室内喂养和田间套笼饲虫实验,实验分别采用不同世代、不同虫龄的美国白蛾幼虫为实验对象,测量其死亡率、化蛹率及取食量等指标,分析转Bt基因杨树对于美国白蛾生长的实际影响,并选取不同部位叶片分析杀虫效果的空间变化。【结果】16个转Bt基因南林895杨株系中,A-4-6、A-5-0、A-5-23和X-2-7株系具有良好的杀虫效果,幼虫取食叶片12 d后的校正死亡率为37.5%～68.9%。A-4-6株系的毒蛋白表达量最高达到11 500.01 ng/g,占总蛋白表达量的0.047 8%。其余5个杀虫活性较好株系的毒蛋白表达量均大于4 669.38 ng/g,除Z-1-3株系,各株系毒蛋白量占总蛋白量均超过0.02%。抗虫效果明显的株系上部叶片的抗虫效果优于中部叶片,下部叶片的抗虫效果差。不同虫龄比对结果表明低龄幼虫的校正死亡率显著高于高龄幼虫（P 0.05）,而化蛹率随着龄期的升高而升高,幼虫对杀虫性的敏感度随着龄期的升高逐渐下降。【结论】转基因南林895杨中Bt基因的表达能够有效的抑制美国白蛾的生长,并具有时空特异性,其中A-4-6、A-5-0及A-5-23三个株系具有良好的杀虫效果,适用于作为抗虫杨树树种进行推广。     

转PeTLP基因‘南林895’杨对土壤微生物的影响及外源基因分子检测

转基因技术是当今林木分子育种的手段之一,但其生物安全性问题广受关注。本研究选择进入田间试验的转PeTLP(类甜蛋白)基因‘南林895’杨Populus deltoides×P. euramericana cv.‘Nanlin 895’为材料,开展转基因杨树对土壤微生物影响及外源基因分子检测等分析。结果显示,转基因杨树在进入田间试验一年后,外源基因仍稳定存在于转基因植株基因组中;转基因与非转基因植株根系周围可培养土壤微生物菌落数量无显著差异,表明外源基因对土壤微生物无显著影响;对土壤微生物总DNA进行分子检测也显示外源基因未有向周围土壤微生物扩散现象;叶片化感作用试验显示转基因植株叶片未对生菜Lactuca sativa L. var. ramose Hort.种子的生长造成显著影响。初步分析结果表明,转PeTLP基因‘南林895’杨在进入田间试验后未出现外源基因水平转移,也未对周围生态环境造成显著影响。     

转Bt基因南林895杨抗虫性及对土壤微生物影响分析

以转Bt基因南林895杨株系B1、B4、B17、B21扦插苗为试验材料,分析其在室内和野外自然条件下对靶标害虫杨小舟蛾幼虫的抗虫性。结果表明:转Bt基因杨树4个株系均有一定的杀虫活性,其中株系B21对杨小舟蛾1龄幼虫12 d校正死亡率高达95.3%;虫试表明转Bt基因杨树各株系扦植苗在野外自然条件下的12 d幼虫校正死亡率8月份为35.0%88.8%,9月份为40.5%95.3%。用转Bt基因杨树叶片饲养杨小舟蛾,对照植株杨小舟蛾幼虫化蛹率为83.3%96.0%,而转Bt基因株系幼虫化蛹率为8.0%76.7%,二者有显著差异。转Bt基因杨树对杨小舟蛾幼虫的生长发育有抑制作用,饲喂8 d后害虫取食量、体质量增长速率显著低于对照。此外,为了解转Bt基因杨树对土壤微生物的影响,对转Bt基因杨树株系及对照进行了根际土壤微生物可培养类群的分析,初步结果显示:转Bt基因杨树根际土壤微生物中细菌、真菌、放线菌的数量与对照比较无显著差异。     

Analysis on Insecticidal Activity of Bt Transgenic Populus deltoides × P.euramericana cv‘ Nanlin895’ and Its Effects on Soil Microorganism

以转Bt基因南林895杨株系B1、B4、B17、B21扦插苗为试验材料,分析其在室内和野外自然条件下对靶标害虫杨小舟蛾幼虫的抗虫性.结果表明:转Bt基因杨树4个株系均有一定的杀虫活性,其中株系B21对杨小舟蛾1龄幼虫12d校正死亡率高达95.3％；虫试表明转Bt基因杨树各株系扦植苗在野外自然条件下的12 d幼虫校正死亡率8月份为35.0％～88.8％,9月份为40.5％～95.3％.用转Bt基因杨树叶片饲养杨小舟蛾,对照植株杨小舟蛾幼虫化蛹率为83.3％～96.0％,而转Bt基因株系幼虫化蛹率为8.0％～76.7％,二者有显著差异.转Bt基因杨树对杨小舟蛾幼虫的生长发育有抑制作用,饲喂8d后害虫取食量、体质量增长速率显著低于对照.此外,为了解转Bt基因杨树对土壤微生物的影响,对转Bt基因杨树株系及对照进行了根际土壤微生物可培养类群的分析,初步结果显示:转Bt基因杨树根际土壤微生物中细菌、真菌、放线菌的数量与对照比较无显著差异.     

南林895杨抗旱耐盐基因DREB1C的转化

以美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨为转基因受体材料,利用农杆菌介导法转化与逆境胁迫相关的DREB1C基因.经潮霉素筛选,共获得80株抗性植株,经PCR及RT-PCR检测有30株抗性植株呈阳性,初步证明DREB1C基因已整合到南林895杨基因组中.抗性试验结果初步表明,转基因植株的抗旱、耐盐性均有所提高.     

两种杨树对铅和铅-镉复合胁迫的生理响应

不同品种的杨树对重金属污染土壤的修复和耐受性存在显著差异,为了解不同品种的杨树对铅(Pb)和镉(Cd)的耐抗特性,以南林95杨和南林895杨为研究对象,研究其在不同浓度Pb胁迫和PbCd复合胁迫下的生理响应,对其根系活力、过氧化氢酶(CAT)活性、可溶性蛋白质和叶绿素含量等指标进行对比分析,并采用主成分分析和隶属函数法综合评价2种杨树对Pb和Cd胁迫的耐受性。结果表明,南林95杨和南林895杨在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下,各生理指标的变化趋势大致相同,均表现出较强的耐受性;在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下,南林895杨的根系活力和CAT活性均强于南林95杨,但其叶绿素含量少于南林95杨。Pb胁迫下,南林95杨的可溶性蛋白质含量略高于南林895杨,在Pb-Cd复合胁迫下则相反。综合评价结果表明,南林895杨对重金属Pb和Cd的耐受性强于南林95杨,具有更好的修复前景。     

南林95杨、895杨繁育技术

南林 95杨、895杨是由南京林业大学选育的杨树品种 ,于 2 0 0 2年9月通过了国家林木良种审定 ,并列入国家首批林木良种名录。南林 95杨、895杨具有速生、优质、多抗、高产等优良特性 ,对杨树食叶害虫有一定抗性 ,主要用于杨树单板用材和纤维用材造林 ,适宜在黄淮、江淮平原及长江中下游平原引种、繁育及推广。南林 95杨、895杨系美洲黑杨杂种 ,具有美洲黑杨的基本形态特征。树形高大 ,干形通直圆满 ,尖削度小 ,分枝粗度中等 ,树皮厚 ,叶片大呈心形 ,一年生枝条灰青色 (南林95杨 )或青绿色 (895杨 ) ,枝条基部圆形 ,中上部微呈五边形 ,木质化…     

RNA干涉培育低木质素杨树

采用改良的CTAB法提取南林95杨的基因组DNA,经PCR扩增得到肉桂酰辅酶A还原酶CCR基因的第4个外显子部分序列,通过中间载体pUCCRNAi,构建含正反向干涉片段的pBI121表达载体,导入农杆菌LBA4404。利用叶盘法侵染南林95杨,获得3株转基因植株,经分子鉴定证实干涉片段已导入南林95杨。测定Klason木质素及综纤维素含量的结果显示:转基因植株Klason木质素含量与对照相比平均降低了9.86%,综纤维素含量与对照相比平均增加了3.17%,纤维长宽比明显增加,均表明转基因植株更有利于造纸。     

水分胁迫下夏蜡梅光合作用的气孔和非气孔限制

在水分胁迫下，夏蜡梅光补偿点、CO2补偿点、气孔阻力和活性氧产生速率升高，光饱和点、表观量子效率、最大净光合速率、羧化效率、蒸腾速率、Fv／Fm和色素含量下降，而暗呼吸速率先升后降、胞间CO2浓度先降后升。轻度和中度水分胁迫下光合能力的下降主要由气孔限制引起，在重度水分胁迫下则由非气孔限制起主要作用。     

Effects of needle age, long-term temperature and CO(2) treatments on the photosynthesis of Scots pine

Naturally regenerated 20-25-year-old Scots pine (Pinus sylvestris L.) trees were grown in open-top chambers in the presence of an elevated temperature or CO(2) concentration, or both. The elevated temperature treatment was administered year-round for 3 years. The CO(2) treatment was applied between April 15 and September 15 for 2 years. The photosynthetic responses of 1- and 2-year-old needles to varying photon flux densities (0-1500 micro mol m(-2) s(-1)) and CO(2) concentrations (350, 700 and 1400 micro mol mol(-1)) during measurement were determined. The CO(2) treatment alone increased maximum photosynthetic rate and light-use efficiency, but decreased dark respiration rate, light compensation and light saturation regardless of needle age. In contrast, the temperature treatment decreased maximum photosynthetic rate and photosynthetic efficiency, but increased dark respiration rate, light compensation and light saturation. The aging of needles affected the photosynthetic performance of the shoots; values of all parameters except photosynthetic efficiency were less in 2- than in 1-year-old needles. The CO(2) treatment decreased and the temperature treatment enhanced the reduction in maximum photosynthesis due to needle aging.     

油茶果实生长期光合特性与经济性状关联分析

为了选筛选出不同光效水平的油茶种质,利用LI-6400便携式光合仪对6个进入盛果期的油茶品种的光合日变化、光响应曲线和CO2响应曲线进行了研究,同时检测了叶片中叶绿素含量和成熟后种籽与果实含油率等经济性状,分析了油茶果实生长期光合特性与经济性状的相关性。结果表明,不同油茶品种间各光合特性参数、叶绿素含量和经济性状指标等均存在差异,‘国油13’和‘湘林210’由于具有较好的光能和CO2利用率、较高的叶绿素含量和含油率等,以及较低的暗呼吸速率,表现出较高的光合效率。最大净光合速率、表观量子效率、羧化效率、光呼吸速率和CO2饱和点与含油率等经济性状呈显著正相关,暗呼吸速率、光补偿点和光饱和点与含油率等经济性状呈显著负相关。     

四种藤本植物光合作用及影响因子分析

应用LI-6400光合作用测定系统,研究了广州市四种园林常用藤本植物光合作用及影响因子分析。结果表明,龙吐珠Clerodendrum thomsoniae和金杯藤Solandra maxima的最大净光合速率较大,使君子Quisqualis indica的最小。龙吐珠的光补偿点和光饱和点都较高,使君子的光补偿点和光饱和点都较低。植物含水率越高,其最大净光合速率和光补偿点就越高,相对叶绿素值与光饱和点之间亦存在此规律。     

天童山常绿阔叶林优势树种光合生理特性在其群落演替中的生态意义研究

对浙江天童山常绿阔叶林组成亚顶级群落的4个优势树种:栲树、木荷、石栎、苦槠的光合生理特性进行了研究。对此4个优势树种幼苗、幼树、成年树等生长阶段的光合响应曲线及其光补偿点和光饱和点、CO2补偿点、光合作用日变化曲线、蒸腾作用和水分利用率等进行了测定,对比分析了优势树种光合生理生态特性及其在天童山常绿阔叶林群落演替过程中的重要作用。结果发现栲树具有最低的光和CO2补偿点、优良的水分利用性能,完善的光抑制自我保护机制,幼苗适应弱光环境且代谢旺盛而利于更新,在4个优势树种中最适应于顶级群落的特殊生境,因此成为了天童山常绿阔叶林自然演替顶级群落中重要值最大的优势种。     

杨树苗期光合特征值与无性系产能相关性的探讨

木材产量是营林工作的终极目标,光合作用是叶绿体利用光合有效辐射将CO_2和H_2O同化为有机物质生产过程,探寻影响产量宏观指标的微观光合特征值,是杨树无性系育种工作的重要内容。为此,对湘林—90等7个杨树新、老无性系进行苗期光响应曲线测定,将暗呼吸速率等5个光合特征值与其主伐阶段的材积生长量作相关分析和逐步回归。在光合特征值中,暗呼吸速率与光补偿点呈紧密负相关关系;模拟光合作用白昼CO_2净同化总量与10年生材积生长量关系最为紧密,影响最大。按多元线性回归标准回归系数判断,各光合特征值对材积生长影响力的排序为:模拟光合作用白昼CO_2净同化总量光合速率光响应曲线实测值之和暗呼吸速率光补偿点光饱和点时最大光合速率。模拟光合作用白昼CO_2净同化总量或光合速率光响应曲线实测值之和可以作为杨树育种苗期选择的重要指标。     

紫花含笑和苦梓含笑光合生理特性的研究

采用Li-6400便携式光合测定系统（Li—Cor Inc．,USA）对常绿灌木紫花含笑和常绿乔木苦梓含笑的光合生理特性进行了测定。结果表明：（1）两种含笑叶片的光响应曲线符合非直角双曲线模型,表观光量子效率接近,但灌木紫花含笑的光饱和点、光补偿点、最大净光合速率、暗呼吸速率均比乔木苦梓含笑低。（2）光照强度对两种含笑的气孔行为、蒸腾速率和水分利用率的影响效果近似,光照强度诱导气孔导度变大,蒸腾速率加强。当达到光饱和后,随着光强的增强,净光合速率增加缓慢,气孔导度和蒸腾速率持续增大,水分利用率下降。     

华南地区常用园林绿化藤本植物光合生理特性研究

采用Li-6400便携式光合测定仪对5种华南地区常用园林绿化藤本植物进行了光响应曲线的测定,并用非直角双曲线模型对其进行拟合,对比分析了5种藤本植物的光补偿点（LCP）、光饱和点（LSP）、最大净光合速率（Pn）、最大表观量子效率（ɑ）。结果表明：5种藤本植物对光照的响应存在着显著差异。使君子的LCP和LSP都比较低,能够充分利用弱光并具有较强的耐荫性;常春麻油藤的LCP和LSP高,对有效光能辐射的利用范围较宽。5种藤本植物的光合速率随光合有效辐射强度的增加出现先升高后平缓的趋势;气孔导度随光强的上升均呈现先上升后降低的趋势;叶片胞间CO2浓度随着光强增大均呈现先快速降低后趋于稳定的趋势;蒸腾速率呈现出线性平缓增长的趋势;而水分利用效率则呈现出先上升后下降类似抛物线的变化。     

苦楝叶片的光合特性研究

利用LI-6400便携式光合作用测定仪对苦楝叶片光合特性进行研究。结果表明:苦楝净光合速率日变化呈双峰曲线,有明显的光合午休现象,最高峰出现在12:00,最大净光合速率为5.63μmol/m2.s,光饱和点为1300μmol/m2.s,光补偿点为34.9μmol/m2.s,表观量子效率为0.1031,CO2补偿点为78.5μmol/mol,羧化效率为0.0332。其光饱和点较高、光补偿点低,表明它是一种既有一定的耐荫能力,又能适应较强的阳光辐射,对光适应幅度较宽的植物。     

Vertical gradients in photosynthetic light response within an old-growth Douglas-fir and western hemlock canopy

We examined needle-level light response of photosynthesis across a vertical light gradient within 45-55-m-tall western hemlock (Tsuga heterophylla (Raf.) Sarg.) and Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco) trees growing in a 400-500-year-old mixed species stand. We determined: (1) whether light-saturated photosynthetic rates, light compensation points, and respiration rates varied from the upper to the lower canopy, and (2) if light-saturated photosynthetic rates, light compensation points, and respiration rates varied between Douglas-fir and western hemlock. Over a 25-m gradient from the canopy top to the lower canopy, mean light-saturated photosynthetic rates, light compensation points, and respiration rates declined in overstory Douglas-fir and western hemlock needles, paralleling a 65% decline in the mean daily photosynthetic photon flux density (PPFD). At the canopy top, increasing light-saturated photosynthetic rates relative to lower canopy needles increased carbon uptake at high PPFD. In the lower canopy, reduced respiration rates relative to upper canopy needles increased carbon uptake at low PPFD by reducing the light compensation point. At all canopy positions, western hemlock had lower mean light-saturated photosynthetic rates, light compensation points and respiration rates than Douglas-fir. As a result, western hemlock had higher net photosynthetic rates at low PPFD, but lower net photosynthetic rates at high PPFD compared with Douglas-fir.