磷脂酶Dβ在拟南芥低温信号中的转导作用

磷脂酶D（PLD）不仅是植物中一类主要的磷脂水解酶,而且是一类重要的跨膜信号转导酶类。PLD的磷脂降解功能和信号转导功能均影响植物的抗冻性。本研究以PLDβ基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型植株为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,并分析其作用途径。结果表明,PLDβ基因介导低温信号转导作用,参与渗透调节途径中脯氨酸的调控和抗氧化系统中过氧化氢酶（CAT）活性的调控,并且与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径。本研究为探索通过调控PLD的活性提高植物抗冻性提供了新的途径,并为深入揭示植物的抗冻机理以及磷脂信号转导机制提供实验支持。     

磷脂酶Dα在拟南芥低温驯化过程中的作用途径分析

本研究对低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶仅基因敲除突变体与野生型拟南芥植株进行冻害胁迫处理后,通过观测植株表型和膜离子渗漏率的变化,鉴定两种基因型植株的抗冻性。结果发现,低温驯化后,PLDα敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,表明PLDα参与植物的低温驯化过程。对其作用途径进行分析发现,PLDα不参与低温驯化过程中ABA信号转导作用,也没有参与SOD、CAT和POD等3种抗氧化酶活性的调节,但是参与低温驯化过程中膜稳定性调节和渗透调节过程。     

PCAM蛋白功能分析及其与油菜素内酯(BR)信号转导关系

为阐明油菜素内酯(BR)和Ca2+信号转导的关系及其在调控植物生长发育过程中的作用机理,本研究利用2D-DIGE技术结合质谱分析在水稻(Oryza sativa L.ssp.Japanica)BR不敏感突变体(d61-4)和BR合成突变体(brd1-3)中鉴定到一个与野生型水稻相比明显上调的蛋白质,通过质谱鉴定,此蛋白为一Ca2+信号转导相关蛋白(putative calmodulin,PCAM);在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达PCAM后转基因株系表现为生长缓慢,植株矮小,整个植株的生长周期明显延长。在过表达PCAM转基因株系中BR信号转导关键基因SaurAC被明显下调。研究结果表明,PCAM参与到BR信号转导途径过程中,在BR调控的植物生长发育过程中起负调节作用,过表达PCAM的转基因植株是抑制BR生理作用的表型。     

At2g29080基因可能参与了拟南芥盐代谢的调节

为进一步阐明植物盐代谢机理，以哥伦比亚生态型（Columbia type)野生拟南芥（Arabidopsis thaliana)及其盐敏感突变性（salt overly sensitive2,sos2）为材料，50mmol/L NaCl处理3d，利用mRNA差异显著显示技术分离得到了只在野生型拟南芥中表达，而在sos2突变体中不表达的一个未知功能的At2g29080基因片段DD156。序列同源性分析表明，它是一类大的蛋白家族AAA ATPase（ ATPase associated to a variety of cellular activities)中一员。Northern blot显示，随着NaCl处理浓度的升高。该基因在野生型拟南芥中的表达量增加。而在sos2突变体中，该基因的表达一直处于很低水平。这是首次发现AAA ATPase与植物的盐代谢有关。进一步研究发现，线粒体细胞色素氧化酶活化的变化，与与该基因在野生型和sos2突变体中的表达呈密切相关。表明该基因的编码产物可能参与了拟南芥线粒体细胞色素氧化酶活性的调控。     

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

异源表达EgrNAC1提高拟南芥抗寒性和对干旱、高盐的敏感性

桉树是我国南方重要用材树种,但其栽培种对低温、干旱和高盐等非生物逆境抗性弱,限制了其栽培范围的扩大和栽培效益的提高。EgrNAC1(Eucgr.I00058)是巨桉中受低温、干旱和高盐诱导表达的NAC类转录因子。为进一步研究EgrNAC1的功能,通过异源转化拟南芥,获得了超表达EgrNAC1的转基因纯合株系,并对其进行低温(-6℃)、干旱、高盐(NaCl 300 mmol·L^-1 )和脱落酸(0.5 μmol·L^-1)处理,分析转基因株系对非生物逆境的响应。结果表明,超表达EgrNAC1能提高拟南芥植株对低温的抗性。-6℃处理12 h,恢复5 d后,转基因株系EgrNAC1-OE1和EgrNAC1-OE8的存活率分别达到88.9%和81.5%,而野生型仅有29.6%。低温处理下,转基因株系中3个低温信号传导(CBF)途径相关的基因,AtCBF1、AtCBF2和AtRD29A的表达量相对于野生型显著上调;超表达EgrNAC1提高了转基因植株对干旱和高盐的敏感程度。同时,转基因植株相对于野生型表现出对ABA敏感性的下降。综上,EgrNAC1在巨桉低温响应中可能作为一个正向调控因子,通过参与调控CBF途径中低温响应相关基因的表达,提高植物在低温逆境下的适应性。但在干旱和高盐逆境下,EgrNAC1可能发挥负调控作用,且这种作用可能与ABA的影响有关。本研究结果为深入了解桉树EgrNAC1的功能以及开展桉树抗逆分子辅助育种提供了一定的理论参考。     

黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达

植物生长素受体是生长素信号通路中的重要因子.基于前期克隆得到了黄瓜(Cucumis sativus)生长素受体同源基因生长素信号F-box蛋白基因(auxin signaling F box protein,CsAFB)和转运抑制响应基因(transport inhibitor response,CsTIR),为进一步证实和研究这2个基因的功能,本研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0野生型和生长素受体编码基因功能缺陷突变体tirl-1为材料,导入黄瓜生长素受体同源基因,获取纯合转基因系.检测发现,拟南芥突变体tirl-1转入CsAFB/TIR基因后根系发育、外源生长素敏感性和细胞伸长反应均恢复至野生型水平.检测发现,野生型拟南芥中过量表达黄瓜CsAFB/TIR,尤其是Cs TIR基因,植株主根伸长明显受抑,侧根数量剧增,子叶下卷,叶柄上翘,真叶叶缘向离轴面弯曲,顶端优势明显.本研究表明,CsAFB/TIR基因功能类似拟南芥TIR1基因,为黄瓜生长素受体同源基因;过量表达该类基因通过增加生长素受体数量、扩大生长素信号的方式参与调控植物生长发育;为进一步在黄瓜中研究生长素受体功能及作用机理提供理论依据.     

巨桉锌指结构蛋白基因EgrZFP7在低温胁迫中的功能研究

锌指结构蛋白(zinc finger protein,ZFP)是一类在植物生长、发育和逆境胁迫响应中发挥重要作用的转录因子。为了挖掘桉树(Eucalyptus)抗寒分子响应中的重要基因资源,为桉树抗低温分子辅助育种提供理论依据,本实验对巨桉(Eucalyptus grandis)在低温处理下受到强烈诱导表达的锌指结构蛋白基因Egr ZFP7(Eucalyptus grandis zinc finger protein 7)编码蛋白结构及其功能进行了研究。该基因是典型的C2H2型锌指结构蛋白基因,编码蛋白序列中含有2个锌指结构基序、1个L-Box基序和1个乙烯响应元件结合因子(ethylene response factor,ERF)相关双性抑制子(ERF-associated amphiphilic repression,EAR)基序。通过构建Egr ZFP7∷GFP表达载体,用基因枪轰击洋葱表皮的方法,进行基因表达蛋白的亚细胞定位,结果表明,Egr ZFP7表达蛋白定位于细胞核。构建35S∷Egr ZFP7超表达载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),得到超表达转基因纯合株系Egr ZFP7-OX1和Egr ZFP7-OX2。与野生型相比,其正常生长条件下侧根的数目和长度增加。以-8℃低温处理3 d、再缓苗恢复3 d,结果显示,超表达转基因株系恢复速度慢,同时幼苗因受低温胁迫的死亡率远高于野生型,说明该基因超表达增加了拟南芥转基因植株的低温敏感性。酵母双杂交文库中筛选到1个与Egr ZFP7互作的乙烯响应因子蛋白Egr ERF4(Eucalyptus grandis ethylene response factor 4)。上述研究结果表明,Egr ZFP7可能通过与乙烯响应因子的相互作用,在巨桉低温胁迫响应中发挥负调控。本研究为进一步了解桉树抗寒分子机理提供了基础资料。     

磷脂酶D参与冬小麦对干旱胁迫的响应

磷脂酶D（phospholipase D,PLD）通过水解细胞膜磷脂产生信使物质磷脂酸（PA）,并介导多种激素与逆境的信号转导过程。为探讨PLD在参与干旱信号转导调控细胞膜稳定性方面的作用及其途径,采用在培养液中加入PEG-6000模拟干旱胁迫,用PLD抑制剂正丁醇（n-butanol,BA）抑制PLD产生PA,对比PEG+BA处理与PEG处理下小麦抗旱性、膜稳定性以及抗氧化酶类的变化。结果表明,与PEG处理相比,PEG+BA处理下,冬小麦幼苗叶片生长受抑制,净光合速率下降,光合非气孔限制作用增强,细胞膜离子渗漏率显著升高,膜脂过氧化产物丙二醛（malonaldehyde,MDA）升高,抗氧化酶POD活性下降,表明PLD参与干旱胁迫下过氧化物酶（peroxidase,POD）活性的调控。由此揭示出一条潜在的由PLD介导的干旱信号转导途径,即干旱胁迫—PLD激活—POD活性增强—保护膜脂过氧化损伤—提高细胞膜稳定性—植物抗旱性增强。     

小麦矮秆突变体DC20赤霉素合成及信号转导途径关键基因表达分析

小麦矮秆突变体DC20是经高能混合粒子场处理得到的,表现为赤霉素敏感型。本文采用实时荧光定量PCR技术,研究该突变体矮秆性状与GA合成及信号转导途径相关基因表达的关系。共检测编码GA合成途径关键酶和编码信号转导途径作用因子的10个关键基因。其中,编码内-贝壳烯杉氧化酶(KO)的GA3基因和编码正调控因子基因GAMYB的表达量极显著下调,下调倍数分别为20.0、3.1;2个编码负调控因子基因GAI和SPY显著上调,上调倍数分别为2.3、1.3。外源GA3(赤霉酸)处理能够抑制编码负调控因子基因GAI、SPY和RGA的转录,而GA合成关键酶基因GA3及正调控因子基因GAMYB转录水平显著升高表明DC20矮秆基因对GA相关途径的受外源GA3的调节。     

中间锦鸡儿CiDREB1C基因增强转基因拟南芥抵抗非生物胁迫的能力

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)是广泛分布于我国西北干旱、半干旱荒漠区的防风固沙先锋树种,具有极强的抗逆性和饲用价值。本课题组从前期建立的干旱处理的中间锦鸡儿转录组数据库中分离到1个脱水响应元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein, DREB)转录因子编码基因片段,为了检测CiDREB1C基因的抗旱和抗冷能力,本研究首先利用qRT-PCR技术检测中间锦鸡儿中CiDREB1C基因在冷和干旱胁迫下的表达水平,发现均有上升(P0.01)。为了验证该基因的功能,本研究利用PCR技术获得了CiDREB1C基因全长(GenBank No. MG748598),并将其构建入植物过表达载体pCanG-HA,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana),获得了超表达CiDREB1C的转基因拟南芥纯合体。不同胁迫处理结果显示:甘露醇处理下,转基因拟南芥丙二醛的含量显著低于野生型(P0.01),叶绿素含量明显高于野生型(P0.01),表现出明显的抗旱表型;冷胁迫处理后,过表达株系叶绿素含量明显高于野生型(P0.01);黑暗处理下,过表达株系叶片衰老延迟,细胞死亡较野生型少,叶绿素含量显著高于野生型(P0.01)。上述结果说明,CiDREB1C基因提高了转基因拟南芥对多种胁迫的耐受性。本研究结果为进一步研究CiDREB1C基因在抗逆中的功能及中间锦鸡儿的抗逆分子作用机理提供依据。     

水分胁迫对向水性突变体rhe2根生长与响应的影响北大核心CSCD

利用非损伤测定技术对拟南芥强向水性突变体rhe2(根毛乙烯突变体)的根系进行离子组学的初步探究。发现在水分胁迫下,与野生型拟南芥WT相比,该突变体能够保持相对稳定的根部质子(H^+)流向与流速;在植物向水性反应的过程中,过氧化氢(H_2O^2)和生长素(IAA)可能在根生长的维持及其相关信号转导过程中扮演重要的角色。     

家蚕杆状病毒bro-d基因缺失对病毒基因转录和细胞凋亡的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bro (baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列.为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除BmNPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕BmN细胞,利用qRT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响.结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P＜0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p1O的转录水平也都显著下降(P＜0.05);iap2的转录水平显著下调(P＜0.05).在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P＜0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P＜0.05),进而导致细胞凋亡水平上升.结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平.研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路.     

月季RhASP1的克隆与抗逆功能初步分析

天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases,APs)是植物体内一类蛋白水解酶,在植物的生长发育过程中发挥极为重要的作用。为了明确月季(Rosa hybrida)中APs的初步功能,本研究以切花月季萨蔓莎(R.hybrida'Samantha')为材料,采用c DNA末端快速扩增PCR(rapid amplification of c DNA ends,RACE-PCR)的方法克隆到一个天冬氨酸蛋白酶基因(APs),命名为Rh ASP1(Gen Bank No.:MG384616),通过q RT-PCR和异源过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)的方法对Rh ASP1的表达特性和在拟南芥中的生物学功能进行了初步研究。结果表明Rh ASP1开放阅读框(ORF)包含1 287 bp,编码428个氨基酸,属于B类型APs;Rh ASP1的表达受盐处理诱导,乙烯处理24 h和失水胁迫3 h显著提高了Rh ASP1的转录水平(P0.05)。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化野生型拟南芥,获得3个超表达转基因株系,并对盐胁迫下转基因植株的表型和生理指标进行了测定。不同盐胁迫浓度处理下,Rh ASP1转基因植株的发芽率、初生根伸长量和侧根数目均显著高于野生型拟南芥(P0.05);与野生型相比较,Rh ASP1转基因株系的叶片和植株染色较浅,O2·和H2O2相对积累量少,且显著低于野生型植株(P0.05)。上述结果初步明确了Rh ASP1的生物学功能,为月季的逆境育种提供了基因储备和理论参考。     

水分胁迫对向水性突变体rhe2根生长与响应的影响

利用非损伤测定技术对拟南芥强向水性突变体rhe2(根毛乙烯突变体)的根系进行离子组学的初步探究。发现在水分胁迫下,与野生型拟南芥WT相比,该突变体能够保持相对稳定的根部质子(H~+)流向与流速;在植物向水性反应的过程中,过氧化氢(H_2O~2)和生长素(IAA)可能在根生长的维持及其相关信号转导过程中扮演重要的角色。     

一个辐射诱变的水稻卷叶突变体的特性研究

通过60Co-γ射线处理籼稻品种青华占的干种子,获得一个稳定遗传的卷叶突变体(γ-rl),对其进行叶片细胞学观察、根形态特性分析及生长素(IAA)和色胺含量的分析。结果显示卷叶突变体γ-rl叶片的中脉面积比野生型增加,而侧脉数目减少;突变体种子萌发后幼苗的主根长度比野生型显著缩短,根总数也显著减少,表明幼苗期γ-rl的根系发育明显差于野生型;突变体γ-rl幼苗的主根生长对外源IAA、IAA抑制剂NPA处理的反应与野生型相比也存在显著差异;在幼苗期,突变体γ-rl叶片内源IAA的含量明显低于野生型,而色胺的含量明显高于野生型,但在抽穗期,突变体γ-rl叶片的IAA和色胺含量与野生型相比均无显著差异。研究结果将为阐明该突变体卷叶突变产生的原因及卷叶相关基因(OsFMO(t))的功能打下基础。     

棉花转录因子GhWRKY11的克隆及功能分析

短季棉(Gossypium hirsutum)的早熟往往伴随着早衰,挖掘和鉴定衰老相关基因对于选育早熟不早衰棉花新品种具有重要意义,而WRKY转录因子广泛参与调控植物衰老过程.本研究克隆了陆地棉WRKY转录因子GhWRKY11(GenBank accession No.JN604988),cDNA全长1 055 bp,包含1 008 bp开放阅读框(open reading frame,ORE),编码335个氨基酸,属于WRKY转录因子Ⅱd亚组.蛋白序列系统进化分析表明,GhWRKY11与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtWRKY11的相似度较高.基因结构分析表明,Gh WRKY11基因有3个外显子和2个内含子.亚细胞定位结果表明,GhWRKY11蛋白定位在洋葱(Allium cepa)表皮的细胞核.qRT-PCR结果分析表明,Gh WRKY11在盛花期的棉花叶片中优势表达,在子叶衰老过程中表达下调.赤霉素(gibberellin,GA3)处理棉花幼苗后,GhWRKY11在2、4、8和12h的表达显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)上调;水杨酸(salicylic acid,SA)处理后,GhWRKY11的表达量随处理时间的增加而逐渐升高,并且在2、4、8和12h的表达极显著(P＜0.01)上调;同时,GhWRKY11可以在某些时间点被脱落酸(abscisic acid,ABA)、乙烯(ethylene,ET)、H2O2和茉莉酸(jasmonic acid,JA)诱导表达上调.GhWRKY11在受到低温(12℃)胁迫处理时表达上调,且在2、8和12h达极显著(P＜0.01);盐胁迫(200 mmol/L NaCl)处理后,GhWRKY11在2、4、8和12 h的表达显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)上调;15％聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG6000)处理后,在12h的表达量极显著(P＜0.01)上调;损伤处理对该基因的表达没有显著影响.播种45 d后,与野生型拟南芥相比,GhWRKY11拟南芥过表达植株衰老延缓,由此推断,GhWRKY11可以延缓植株衰老,初步鉴定GhWRKY11是衰老的负调控因子.该基因的克隆和功能的初步分析为创制转基因抗早衰棉花材料提供基础资料.     

STMP在拟南芥分枝发育过程中的功能鉴定

拟南芥(Arabidopsis thaliana)中含有脂/固醇结合的相关脂转移蛋白结构域(steroidogenic acute regulatory related lipid transfer,START)的膜相关蛋白(START domain containing-membrane related protein,STMP),STMP是START保守域(第84～295位)功能未知的蛋白质,由440个氨基酸组成、具有跨膜片段、属于磷脂酰胆碱转运蛋白.为明确STMP在拟南芥发育调控过程中的作用,深入了解拟南芥发育调控的分子机理,本研究用35S强启动子启动START结构域,构建START结构域的过表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染花序法把STMP的过表达载体转入野生型拟南芥,获得过表达STMP的转基因拟南芥,并用qRT-PCR技术进行验证;分析转基因拟南芥分枝发育状况,明确STMP在拟南芥分枝调控过程中的作用;用qRT-PCR技术分析STMP的时空表达特性;构建STMP和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的融合蛋白载体,把此载体转入野生型拟南芥中,对转基因拟南芥中GFP进行荧光观察,从而对STMP进行亚细胞定位.本研究获得了过表达STMP的转基因株系;过表达STMP的转基因拟南芥分枝比野生型明显增多,突变体stmp的分枝减少;STMP的时空表达特性分析表明,茎中STMP的表达量最高,STMP定位在细胞质膜和细胞质中.结果表明STMP可以促进拟南芥的分枝发育,本研究对完善拟南芥分枝调控机制具有重要的意义,可以为植物株型的定向设计提供理论依据.     

雷竹VRN1同源基因克隆及功能分析

拟南芥VERNALIZATION 1(VRN1)基因是一个介导春化途径,调控开花时间的基因。为了研究竹类植物中VRN1同源基因的功能,采用同源克隆技术从雷竹中分离到一个VRN1同源基因,将其命名为PvVRN1。序列分析表明,该基因编码245个氨基酸,与小麦、水稻中VRN1同源基因相似性分别为86.56%和88.98%。实时荧光定量PCR结果表明,PvVRN1在开花雷竹中的表达量高于未开花雷竹;在开花雷竹中,PvVRN1在秆、花、叶芽中表达量相对较高。亚细胞定位分析表明,PvVRN1蛋白质主要存在细胞核中。PvVRN1在拟南芥中的过表达使转基因植株矮小,花瓣和萼片比野生型短,但是在开花时间上与野生型无差异,表明PvVRN1基因可能参与雷竹花形态建成以及其它发育过程。本研究结果可为阐明竹子开花机制提供科学依据。