芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦体表定殖的初探

 将来自质粒pAD4412的启动子和绿色荧光蛋白基因gfpmut3a插入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成芽孢杆菌表达载体pGF P4412,用其转化野生型生防芽孢杆菌83-6和A-47等8个菌株,均得到良好的发光表型。质粒稳定性实验表明重组质粒pG FP4412稳定性为92%。借助荧光显微镜对gfp标记的菌株A-47-gfp在小麦体表的定殖进行初步的研究。结果表明:A-47-gfp能够在小麦根际及小麦体表定殖(包括根表和茎叶表面);相对于在茎叶表面定殖的A-47-gf p在根表定殖的菌体与根的结合更为牢固;从根基到根尖A-47-gfp的定殖量有明显的减少趋势。     

产酶溶杆菌OH11菌株α-水解蛋白酶基因的克隆与表达

α-水解蛋白酶是产酶溶杆菌OH11菌株分泌的一种胞外丝氨酸蛋白酶。利用PCR方法从OH11菌株中克隆到该基因。同源性比较其推测产物与产酶溶杆菌ATCC29478菌株和ATCC29487菌株的α-水解蛋白酶有90%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET30a( )上构建重组质粒pαLP,并转化宿主菌BL21(DE3)获得BLαLP表达菌株。经IPTG诱导后发现BLαLP菌株产生一相对分子量约为44kD的蛋白。研究表明,该蛋白能将蛋白质水解,在脱脂奶粉培养基上形成水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。     

芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌B418中的表达

采用PCR技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列。片段共2227bp,含有一个具有1788个核苷酸的开放阅读框架,起始密码子位于211bp,终止密码子位于1998bp,共编码氨基酸605个。序列比较发现同已发表的枯草芽孢杆菌几丁质酶核苷酸具有99.39%的同源性。将该基因与大肠杆菌-伯克氏菌穿梭质粒pRK415连接,获得重组质粒pRChi113。重组质粒电击转入伯克氏菌B418中,获得工程菌株B418-9、B418-13。与野生菌株B418相比,平板拮抗试验表明,工程菌株B418-9、B418-13对大丽花轮枝孢、立枯丝核菌、麦根腐长蠕孢、禾谷丝核菌抑菌效果明显提高。     

GFP标记生防细菌B579及其定殖能力检测

 利用绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）标记靶标微生物是目前研究微生物和宿主互作的重要手段。在本研究中,作者用电击转化的方法将携带质粒gfpmut3a基因的穿梭载体pGFP4412导入生防枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B579中,并得到成功表达GFP的枯草芽孢杆菌B579-gfp。用抗生素平板回收结合激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察对枯草芽孢杆菌B579-gfp在盆栽的黄瓜根表定殖情况进行了研究,结果表明：标记菌株在激发光波长为488 nm的蓝光下可观察到亮绿色的荧光;B579-gfp菌体能够定殖在黄瓜根部,在根基部和中部都有菌体聚集而形成膜状结构,在根的分叉和根冠处可观察到大量B579-gfp定殖;浸种、蘸根以及灌根接种均可回收到大量的B579-gfp,分别为4.0×10³、1.0×10⁴和2.0×10² cfu/g。     

内生细菌B3-7 的运动性参与其在小麦根系的内生定殖和对小麦全蚀病的生物防治

 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B3-7 是一株对于小麦全蚀病具有有效生防作用的小麦内生细菌。为了研究B3-7 在小麦根内的定殖机制,本研究将含有转座子TnYLB-1 和温度敏感型复制子的质粒pMarB 转化B3-7 菌株,高温处理后TnYLB-1 插入细菌基因组中,构建转座子插入突变体库。通过筛选,获得1 株在小麦根内定殖能力显著降低的突变体B3-7-458。利用反向PCR 方法分离转座子插入位点的侧翼序列并分析其特征,发现转座子插入导致细菌鞭毛运动性相关基因mota 失活,同时发现mota 失活菌株对于小麦全蚀病的生防能力降低。通过构建互补载体对突变基因mota 进行互补分析,发现互补菌株的运动性、在小麦根系内部的定殖能力以及对于小麦全蚀病的生防能力得以恢复。本研究证明了生防菌蜡样芽孢杆菌B3-7 的mota 基因参与该菌株在小麦根系的内生定殖,也参与了该菌株对于小麦全蚀病的生物防治。     

生防菌株ZA1的GFP基因标记及其功能稳定性测定

为明确生防莫海威芽胞杆菌Bacillus mojavensis菌株ZA1在作物体内定殖与作物和病原物的作用机理,运用电击转化法将绿色荧光蛋白表达载体pGFP78导入菌株ZA1体内,并采用细菌培养法、继代培养法和平板抑制法检测其功能稳定性。结果表明,质粒pGFP78成功导入菌株ZA1,标记后菌株ZA1-gfp经形态学和分子生物学验证均证明菌株ZA1已成功标记,标记菌株ZA1-gfp与菌株ZA1形态一致,在荧光显微镜下呈现明亮的绿色,并且能够提取导入质粒pGFP78,扩展出质粒所携带的启动子78序列。功能稳定性鉴定结果表明,标记菌株ZA1-gfp遗传稳定性达100%;与菌株ZA1的生长速率差异不显著,且不影响菌株的运动性;菌株ZA1对马铃薯枯萎病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯坏疽病菌的抑制率分别为64.50%、68.35%和66.55%,标记菌株ZA1-gfp对3种病原真菌的抑制率分别为67.46%、76.56%和66.75%,表明外源质粒的导入,不影响菌株的抑菌能力。     

蜡样芽孢杆菌M22Fe-SOD基因克隆及其分析

 通过筛选蜡样芽孢杆菌M 22基因组文库, 得到约3.9 kb的基因组片段。BLAST结果显示:其中包含1条长度为915 bp、编码304个氨基酸的超氧化物歧化酶(SOD)基因, 其与Bacillus thuringiensis和Bacillus anthracis中的sodF基因同源性高达95%。此sodF基因能互补恢复大肠杆菌SOD缺陷型菌株QC871在10 μmol/L paraquat中的生长能力。对重组表达蛋白的抑制实验表明, 此SOD基因为Fe-SOD。利用pET-30b (+)构建表达载体pET-sodF并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导后, SOD融合蛋白表达量显著增加。构建自杀载体p299-8, 同源重组突变蜡样芽孢杆菌M22 sodF基因后, 突变体抗氧化能力未显著降低。     

拟南芥诱导型启动子rd29A的克隆及其功能鉴定

以改善作物抗旱性为目的,采用PCR方法从拟南芥中克隆了诱导型启动子rd29A,序列分析发现克隆的rd29A启动子与已发表的rd29A启动子序列(D13044)的同源性为99.47%。利用DNA重组技术成功构建了rd29A启动子驱动GUS基因的植物表达载体p BI121-rd29-GUS,并通过农杆菌介导法转化烟草,转基因烟草叶片中GUS酶活性的组织化学检测结果表明,rd29A启动子能驱动目的基因的有效表达。因此,可以在后续的马铃薯抗旱转基因研究中直接应用。     

刺糖多孢菌bldD基因过表达对多杀菌素合成及其孢子形成的影响

bld D基因是链霉菌中的全局性调控基因,调节菌体的形态分化与次级代谢产物的合成。本研究采用重叠延伸PCR将bld D基因置于红霉素强启动子(Perm E)的控制下克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭载体p UC-spn上,构建重组载体p UC-spn-Perm E-bld D;通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中,获得遗传性能稳定的重组菌株S.spinosa-Bld D。平板培养观察发现,在BHI和TSB平板上,重组菌株的孢子形成受到明显抑制。摇瓶发酵结果显示,重组菌株多杀菌素产量相比对照菌株提高了1.35倍。因此,bld D基因的过量表达在一定程度上抑制刺糖多孢菌的孢子形成,并有效促进多杀菌素的生物合成,为研究其他正调控基因的过量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了重要基础。     

聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响

聚磷酸激酶基因(Polyphosphate kinase gene,ppk)是放线霉菌中的一种影响抗生素合成的全局性负调控因子,阻断该基因能显著提高其次级代谢产物产量。本文利用PCR扩增了刺糖多孢菌中的ppk基因中间片段,经酶切连接技术将其克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pOJ260上,构建阻断型载体pOJ260-ppk;通过接合转移将该功能质粒导入刺糖多孢菌中,获得了遗传性能稳定的重组菌株S.sp-△ppk。对工程菌株的PCR检测结果显示,ppk基因片段已整合到刺糖多孢菌染色体上并成功阻断了该基因的表达。摇瓶发酵结果显示,工程菌株多杀菌素产量较原始菌株提高了122%。阻断聚磷酸激酶基因的表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长发育产生了影响,并有效地促进该菌多杀菌素的生物合成。     

运用电激转化技术构建杀虫工程菌

将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素杀虫蛋白基因(简称Bt基因)导入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),创建新型微生物农药,在国外已有产品试销。在国内,也已引起广泛重视。本实验室曾运用转座子接合转移技术,将Bt基因导入对小麦全蚀病防治效果显著、并有促进植物生长作用的荧光假单胞菌P303菌株中,构建了兼有杀虫防病作用的工程菌。此后,又运用电激转化技术将带有Bt基因的重组质粒转入P303菌株中,获得了具有杀虫活性的PT410、PT415等工程菌株。     

蜡样芽孢杆菌A47鞭毛蛋白基因的克隆及其定殖相关性初探

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内, 并与寄主植物建立一定和谐关系的一类微生物。诸多研究结果表明,部分植物内生细菌对植物是有益的,因此,目前对植物内生细菌的研究已成为国内外研究的热点之一。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)A47是本实验室从小麦根部分离的一株内生增产细菌。它可以在小麦的根围和根内定殖,但其定殖机理目前尚不清楚,本研究从该菌的鞭毛蛋白基因入手,克隆该基因并采用插入突变方法获得突变菌株,再比较突变菌株与野生菌株之间的差异,为明确细菌的定殖因子做一些初步探索。由鞭毛蛋白基因的同源序列设计引物,以蜡样芽孢杆菌A47的基因组DNA为模板,扩增获得了两个鞭毛蛋白基因,分别命名为flaA和flaB;选取     

葡萄霜霉病拮抗细菌N22的筛选鉴定及其防效初探

采用叶盘法筛选到1株防治葡萄霜霉病效果较好的芽孢杆菌N22菌株,并对该菌株进行了鉴定。结果表明,用N22菌株的16S r DNA序列与其相关种属进行比对,其序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都具有100%的相似性。系统发育分析也表明,N22菌株和枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌聚在一个枝上。经进一步克隆了该菌株的gyr A基因序列,其比对结果中相似度高的菌株中只出现了解淀粉芽孢杆菌,其Query cover达到91%。因此,该菌株最终鉴定为解淀粉芽孢杆菌。以解淀粉芽孢杆菌N22菌株的田间防效显示,当发酵液菌体孢子含量为10~7个/m L的防治效果最好,防效可达76.94%。     

水稻中与白叶枯病菌hrf1基因同源序列克隆及功能分析

利用PCR技术从粳稻R109中克隆到与hrf1同源的序列,命名为hpfr1,与hrf1基因的同源性为92%。推导的氨基酸同源性为74.8%。hpfr1基因连接到含T7启动子的高表达载体pET30a（＋）上构建重组质粒pHOSJ4,并转化宿主菌BL21（DE3）产生表达菌株BL21（DE3）/pHOSJ4。hpfr1与hrf1基因在起始密码子ATG至225个碱基处完全相同。将ATG至225碱基的序列克隆,并构建表达载体pHOSJ4-225,表达产物注射烟草能引起过敏反应。BL21（DE3）/pHOSJ4和BL21（DE3）/pHOSJ4-225的蛋白抽提物诱导烟草抗烟草花叶病毒病均达极显著水平,浓度为60μl/ml时防效最显著,分别为96.35%、95.4%,与harpinXoo防效（95.9%）相近。     

核盘菌转录因子SsMCM1原核表达与亚细胞定位

 核盘菌是一类寄主范围广泛的植物病原真菌。MADS-box蛋白家族基因广泛存在于生物体中,参与调控细胞识别、新陈代谢、细胞周期等。核盘菌转录因子SsMCM1调控其子实体形成与致病性。为进一步揭示SsMCM1的作用机制,本研究以核盘菌野生型菌株uf-70的cDNA为模板,扩增得到SsMCM1基因,并与原核表达载体pET-28a(+)连接,构建成重组质粒转化到大肠杆菌BL21(pLysS)表达菌株中,通过IPTG的诱导和亲和层析,纯化得到SsMCM1蛋白,并以此为抗原获得抗血清,完成效价测定。利用特异性抗血清,与核盘菌不同组织蛋白进行特异性的免疫结合,发现其与核盘菌总蛋白、核盘菌细胞质总蛋白均特异性结合,而核盘菌细胞壁蛋白未发现特异性反应,表明SsMCM1不定位于核盘菌细胞壁上。此外,构建其亚细胞定位载体pCG-1301::SsMCM1,并将重组质粒转化到农杆菌中,通过农杆菌的侵染作用进行瞬时表达,发现SsMCM1定位于细胞核中,作为转录因子调控核盘菌的子实体发育与致病性。     

广谱生防菌对番茄枯萎病的防病效果及其机理

筛选于健康大豆植株根部的4株拮抗菌,室内平板对峙试验表明,其对番茄枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersic及其他多种病原菌有广谱抑菌能力,最佳抑菌率可达51.00%~86.81%,无菌滤液及挥发性气体亦有广谱抑菌效果。盆栽试验表明,其对番茄枯萎病有良好防控效果,发病程度降低了42.33%~51.33%,而菌株SR10和SR22处理与苯菌灵的防病效果无差异。16S r RNA种属鉴定其为多粘芽孢杆菌(SR10、SR11),油菜假单胞菌(SR21)和解淀粉芽孢杆菌(SR22)。代谢特性检测表明,4株菌均能产生蛋白酶、β-1,3葡萄糖酶、HCN、IAA、SA;不分泌几丁质酶;菌株SR10、SR11和SR22能够固氮;菌株SR21能水解产生磷酸盐;菌株SR21和SR22可以产生铁载体。抗生素合成基因检测显示3株芽孢杆菌属菌株(SR10、SR11、SR22)均具有杆菌溶素基因(bac A)和脂肽基因(srf AA),菌株SR10和SR22具有伊枯草菌素A基因(itu D),菌株SR22具有丰原素基因(fen D)和芽孢菌霉素基因(bmy B);假单胞菌属菌株SR21具有藤黄绿菌素基因(plt D)、硝吡咯菌素基因(prn D)和2,4-二乙酰藤黄酚基因(phl D)。     

马铃薯黑胫病生防菌株的筛选与鉴定

利用本实验室前期分离保存的58株芽孢杆菌进行马铃薯黑胫病生防菌株的筛选与鉴定,旨在为内蒙古地区马铃薯黑胫病的防治探索新方法。经平板初筛,共有17个菌株对马铃薯黑胫病菌(Pectobacterium atrosepticum)具有拮抗活性,占供试菌株的29.31%;进一步复筛获得拮抗效果较好的5个菌株,分别为Chi8-7、Genyun4-4、Gen7-4、Jing6-7、S-7。其中,菌株Genyun4-4的抑菌效果最为明显,抑菌圈宽度达到20.7 mm,显著高于其他供试菌株处理,且生物活性测定结果也表明该菌株的抑菌效果较好。通过形态学观察、分子鉴定和生理生化特征测定,菌株Chi8-7鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、Genyun4-4鉴定为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、菌株Gen7-4、Jing6-7和S-7均鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus)。     

田旋花EPSPS基因表达载体的构建及拟南芥转化

根据田旋花(Convolvulus arvensis L.)EPSPS基因(Gen Bank登录号:EU698030)c DNA序列,设计含有酶切位点的特异性引物,以田旋花c DNA为模板,合成EPSPS基因并连接到含有35S启动子和GUS基因的p BI121载体上,成功构建植物超表达载体p BI-EPSPS。采用氯化钙冻融法将其转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,然后用根癌农杆菌介导法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),共获得15株卡那霉素抗性拟南芥苗。对其中的5株进行PCR和RT-PCR检测,结果表明EPSPS基因已整合到拟南芥的基因组中并可以表达。     

绿色荧光蛋白标记荧光假单胞菌P303及其生存能力检测

构建了含有荧光假单胞菌自身启动子PP303的中间质粒载体pGFP.然后利用mini-Tn5转座子,通过接合转移,将两个带有不同启动子的绿色荧光蛋白基因分别整合到荧光假单胞菌P303染色体上,获得了在488nm波长下发光稳定的P303m1和P303m3菌株.PCR鉴定和Southern印迹结果均证明绿色荧光蛋白已随机插入P303染色体.SDS-PAGE结果表明,含有PA1/04/03启动子的P303m3菌株GFP表达量低于含有PP303启动子的P303m1菌株,染色体标记的GFP表达量低于质粒标记.室内平板抑菌试验结果表明,P303m1与出发菌株P303抑菌活性相当,对九种植物病原真菌有较强的拮抗作用.定殖、生存竞争能力研究表明,荧光假单胞菌在自然土壤中和大白菜根际都具有较强的定殖能力.P303和P303m1在自然土壤中第60天的菌量分别为1.63×104和3.3×102cfu/g土(湿重),大白菜根际第50天的菌量分别为3.29×106和4.1×104cfu/g根(湿重).     

广宿主Ti质粒virA毒力基因对窄宿主根癌农杆菌MI3—2菌株宿主范围的扩展作用

 生物3型葡萄根癌农杆菌MI3-2有很窄的宿主范围,除了葡萄外,只对少数植物能致瘤。我们先前的研究曾观察到,MI3-2菌株的DNA与广宿主根癌农杆菌A348的PTiA6质粒毒力区virA基因座和T-DNA的tms基因不同源⁽¹⁾。本实验把含有PTiA6质粒T_L-DNA片段及毒力区各基因座(virA,B,G,c,D和E)片段的粘粒(cosmid),通过三菌接合引入MI3-2菌株,组成局部二倍体,使之与MI3-2Ti质粒中相对应的基因互补。用这种转移接合子感染植物表明,引入有T_L-DNA片段或virA基因座的MI3-2,均能使宿主范围有所扩大,并能在落地生根致瘤。本文提出了广宿主virA基因对根癌农杆菌宿主范围的作用。