奶牛孕酮单克隆抗体的制备及其鉴定

国内外研究表明通过对奶牛血液及乳汁中孕酮水平的检测能有效的用于奶牛发情鉴定、妊娠诊断及繁殖障碍性疾病的监测。本研究旨在制备鼠抗孕酮单克隆抗体,为奶牛孕酮免疫学检测技术提供研究基础。实验采用碳化二亚胺方法合成孕酮完全抗原,经SDS-PAGE电泳及紫外分光光度计扫描鉴定,结果表明孕酮免疫抗原(P4-BSA)及检测抗原(P4-OVA)合成制备成功。乳化后的P4-BSA经皮下免疫小鼠,三免后血清效价可达到1∶64000。采用聚乙二醇化学融合方法进行细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,最终获得一株能稳定分泌Ig G1型抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株,诱生的腹水经辛酸硫酸纯化制备,抗体的特异性较好。     

氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定

采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板检测抗体效价。免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合获得了5株(4F11、2C3、8G2、3C1、2G8)稳定分泌抗FLE抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型鉴定均为IgG1。将3C1接种小鼠制备腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化,纯化后腹水效价1∶1 024 000。抗体分子量160.766 KD,亲和常数为8.57×108M-1。     

测定奶孕酮分析奶牛胚胎死亡

测定奶孕酮分析奶牛胚胎死亡○中国农业科学院畜牧研究所（北京１０００９４）蔡正华卢雁平○北京奶牛中心良种场宣柏华○北京西郊农场奶牛公司郑明国孙永芳测定奶孕酮作奶牛早期妊娠诊断，检出未孕牛（负诊断）的准确率相当高，一般都在９５％以上。但是确定妊娠牛（正诊...     

应用EPF抗血清进行奶牛超早期妊娠诊断的研究

为了建立一种快速、高效的奶牛早期和超早期妊娠诊断的方法,采用多肽合成仪合成了早孕因子(EPF)的部分肽段(MC29),将MC29与载体蛋白BSA连接后免疫Balb/C小鼠,制备EPF抗血清,用EPF抗血清阻断ELISA对6头奶牛进行超早期妊娠诊断。结果表明:妊娠10～21d的4头奶牛血清检测均为阴性,2头未妊娠奶牛血清均为阴性,该结果与输精2个月后的直肠检查和B超鉴定的结果相一致。说明应用EPF抗血清进行阻断ELISA可以准确的进行奶牛超早期妊娠诊断。     

用反向亲和层析法纯化猪瘟病毒抗原

用兔抗牛睾丸细胞培养物的IgG琼脂糖4B偶联制备亲和层析柱,以反向亲和层析法纯化SFV—C抗原,即通过亲和层析免疫吸附除去PEG沉淀法部分纯化抗原中的残留牛睾丸细胞培养物成分。结果表明.通过3次反向亲和层析柱的纯化抗原.其总蛋白去除率达76.9％;应用纯化前后抗原检测猪瘟免疫血清.纯化抗原可以除去猪瘟免疫血清中的非相关抗体反应,确保猪瘟免疫抗体检测的特异性.     

奶牛孕酮免疫胶体金快速检测试纸条的研制

为了及时、准确地诊断母奶牛妊娠状态,研究建立了奶牛孕酮(P4)胶体金免疫层析法的快速检测技术.先制备完全抗原(P4-BSA),用其免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,抗体经亲和纯化后测定其浓度.采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直径为15 nm的胶体金,以P4-OVA和羊抗鼠二抗分别作为检测带和质控带包被在硝酸纤维素膜上,将...     

奶牛乳汁孕酮EIA快速诊断试剂盒的研制与应用

应用乳汁孕酮酶免疫快速测定法对奶牛进行发情鉴定和妊娠诊断的研究,周外已有很多报道,而且至少现已有11种诊断盒供应市场。国内在近几年尽管已建立了孕酮酶免疫测定方法,并用于奶牛早期妊娠诊断,但尚未研制出快速测定试剂金供应市场。目前,同外生产的孕酮EIA快速诊断盒进行奶牛早期妊娠诊断平均每测一个样本约需成本1英磅(合人民币9元)左右。在外汇紧张、资金短缺的条件下,依靠进口来满足国内市场需要显然是不可能的。为此,我们在以前的工作基础上,利用孕酮EIA定量测定试剂研制奶牛乳汁孕酮EIA定性快速妊娠诊断试剂盒,现已取得初步成功。应用该试剂     

孕酮免疫生物传感器在奶牛上的临床应用

为了解孕酮免疫生物传感器的临床应用效果,本试验对7头妊娠奶牛,8头产后发情奶牛和18头乏情奶牛的血浆雌二醇、促黄体素、促卵泡素和孕酮浓度进行了检测,同时应用的孕酮免疫生物传感器进行了乳汁孕酮检测。结果显示,孕酮免疫生物传感器检测的乳汁孕酮水平与ELISA检测血浆孕酮含量之间呈正相关。该优化的生物传感器检测奶牛妊娠的孕酮浓度范围为10~15 ng/mL,发情的孕酮浓度范围为4~10 ng/mL;持久黄体的孕酮浓度范围为10~16 ng/mL,卵巢静止的孕酮浓度范围为3~7 ng/mL,黄体囊肿的孕酮浓度范围为12~18 ng/mL。表明该孕酮免疫生物传感器能有效的检测奶牛妊娠、发情和繁殖障碍疾病的乳汁孕酮水平。     

奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验

用抗孕酮单克隆抗体S3B2D4A6和羊抗鼠IgG分别固定于硝酸纤维膜，并与胶体金标记的抗孕酮单克隆抗体S3B3E1G1及其它试剂，应用层析式双抗体夹心法原理研制奶牛早孕诊断试纸，在北京10家奶牛场进行临床检测试验，对1559头荷斯坦奶牛乳汁中孕酮含量进行临床符合验证。结果表明。该试纸条灵敏度高，最低检出量达5～8ng／mL。与无关抗原均无交叉，且批内、批间变异小；检测1559头奶牛。孕牛1316头，其中试纸检测结果阳性1274头。可疑32头。复测阳性22头，孕牛阳性临床符合率96．8％；复测后阳性总符合率达98．5％。阴性对照243头，其中试纸检测结果阴性236头。可疑6头。复测阴性2头。阴性临床符合率为97．1％。复测后阴性总符合率97．9％。结论：北京万华生物工程有限公司研制的奶牛早孕诊断试纸能够快速、准确地进行奶牛早期妊娠诊断。     

河北唐山地区奶牛早期妊娠诊断技术应用与推广

"奶牛早期妊娠诊断技术推广项目"技术成果是北京爱德士元亨生物科技有限公司生产的"28天早期可视孕检试剂盒"科技产品及相关技术,是通过检测牛血液中妊娠相关物质(PAGs)的含量从而诊断早期妊娠的一项技术,目前,该技术处于世界领先水平。通过该技术及产品的应用,为规模奶牛场提供了一种全新的奶牛妊娠诊断工具和方法,能尽早、准确地诊断参配母牛是否成功妊娠,进而区别饲养管理,尤其对于发现的空怀牛,尽早安排下一次配种处理,从而不耽误生产,该技术能有效缩短奶牛空怀天数,节约饲养成本,显著提高奶牛场繁殖状况和经济效益。与其他牛妊娠诊断方法和产品相比,该产品及方法目前最科学有效,尤其适用于现代化的大型奶牛场。     

检测奶牛乳汁孕酮的免疫生物传感器优化

为了完善已建立的孕酮免疫生物传感器的检测性能,本试验应用碳化二亚胺法将11α-羟基孕酮半琥珀酸和OVA制备成孕酮完全抗原,其浓度达0.6 mg/m L。在此基础上建立了以乳汁为基质的孕酮生物传感器的标准曲线(y=-4.9461x+8.7982,R2=0.993 2),进一步确立了检测乳汁孕酮的线性范围为0.31 ng/m L~50ng/m L,检测限为0.31 ng/m L,灵敏度为0.15 ng/m L,而且孕酮与皮质酮、皮质醇、雄烯二酮的免疫交叉反应较低,表明特异性较好。批内、批间变异系数分别为7.7%和7.5%,回收率为95.8%~115.7%,生物传感器稳定性在4℃保存4 d。该优化的奶牛乳汁孕酮免疫生物传感器的性能参数符合规定的标准,为检测妊娠、乏情和繁殖障碍疾病的奶牛乳汁孕酮含量提供了工具。     

奶牛场常用早期妊娠诊断技术研究进展

准确的妊娠诊断是奶牛场提升繁殖管理水平的重要手段之一。本文从诊断时间、操作繁琐程度、成本、准确度等方面,比较分析了直肠触诊法、超声波检查法、孕酮检测法、牛妊娠相关糖蛋白检测等奶牛早期妊娠诊断方法的优劣势,同时对各种诊断技术的发展进行了展望,为牧场繁殖管理实践提供指导。     

免疫乳胶测定法对奶牛妊娠诊断试验

奶牛的妊娠诊断是早期发现空怀,尽早采取措施复配,不致延误配种季节而担误生产。早期妊娠诊断技术跟不上,势必丧失配种期,就会直接影响犊牛繁殖计划和产奶量计划,大大影响了经济效益。目前对奶牛早期妊娠有直肠触诊法,它准确率高,但存在费体力和寒冷天气操作不便等缺点;最近几年采用免疫学的妊娠诊断法,如HCG放射免疫测定法,红血球凝集抑制法,血浆或乳汁的孕酮放疫免疫测定法等,它们虽然准确率高但     

奶牛孕酮单克隆抗体的制备与初步鉴定

试验应用淋巴细胞杂交瘤技术,以制备的P4免疫抗原免疫Balb/c小鼠为试验动物,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法进行细胞克隆,经过3次克隆筛选,最终获得2株能稳定分泌P4单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为8G6、11A11.杂交瘤细胞培养上清液和小鼠腹水中2株单抗ELISA效价分别为1∶512 000,1∶216 000.单克隆抗体与检测抗原和对照均不发生交叉反应,显示出良好的特异性,灵敏度高,且8G6的亲和力优于11A11.奶牛孕酮单克隆抗体的获得为P4检测试剂盒的研制奠定了基础.     

家畜外周血浆孕酮水平及其在兽医产科上的应用(续)

(二)血浆孕酮水平的应用早期妊娠诊断 Shemesh等(1968)在研究早期胚胎对外周血浆孕酮水平的影响时发现,排卵后第10—18天,未授精牛、授精后妊娠牛和空怀牛的孕酮水平相似,但是在排卵后第19天,妊娠牛和空怀牛的孕酮水平有明显差异。此时,空怀牛的黄体发生正常的退化,孕酮水     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白.融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体.3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3 200.Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应.应用3株单抗均可特异性检出EHEC O157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应.     

肠出血性大肠杆菌O157：H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。     

孕酮ELISA试剂盒在牛奶乳汁检测中的初步应用

本实验利用自建的奶牛乳汁孕酮竞争ELISA法(酶标抗原法)研发了奶牛乳汁孕酮ELISA试剂盒。通过对试剂盒的特异性、灵敏性、重复性、稳定性和回收率等主要性能进行优化试验。结果表明:试剂盒可以在4℃条件下保存9个月,与睾酮、雌三醇、雌二醇无特异性反应,灵敏度为0.14 ng/mL,批内差异为4.11%,批间差异为6.26%,回收率为93.80%~107.60%,变异系数为5.65%。应用该试剂盒检测乳汁孕酮诊断奶牛妊娠与未妊娠的准确率分别为93.3%和95.8%。因此,该试剂盒性能良好,妊娠诊断效果理想,为今后在奶牛生产中的广泛应用奠定基础。     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体制备及鉴定

为制备鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的SVCV免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤细胞技术,制备2株抗SVCV的MAb,分别命名为2A3和3H7。经间接ELISA检测腹水效价为1:10240和1:12150。亚类鉴定证实,这2株亚类均为IgG1型。经非竞争酶免疫试验测定2A3和3H7的抗体亲和力常数分别为4.86×108L/mol和1.86×109L/mol,3H7相对亲和力高于2A3。MAb 2A3和3H7的饱和度均为1:400,叠加试验所得增值指数为63.2%,大于50%。抗体反应增值结果表明:两株MAb分别针对不同抗原位点。免疫印迹分析检测表明,两株纯化的MAb均可与SVCV抗原发生特异反应。     

牦牛发情周期和妊娠早期乳脂孕酮水平的变化

采用放射免疫分析法对牦牛发情周期和妊娠早期的乳脂孕酮水平进行了测定,并对应用乳脂孕酮测定进行耗牛早期妊娠诊断的方法作了探讨。4头牦牛发情周期乳脂孕酮水平的变化类型与奶牛基本相似。发情期的乳脂孕酮含量低,为0.10±0.01(S.E.)ng/10μl;发情终止后4～5天,孕酮含量开始显著升高(P<0.01),并分别于周期第16,17,21和22天(周期长度分别为20、24、25、27天)达到峰值,平均为1.69±0.10(S.E)ng/10μl,下次发情前2天孕酮含量急剧下降到较低水平,于下次发情时重返到基础水平。15头牦牛妊娠12—30天的乳脂孕酮含量维持较高水平,平均为2.18±0.05(S.E)ng/10μl,妊娠18、20、22、24、26、28和30天的孕酮含量极显著高于8头未孕牛授精后相应各天的孕酮含量(P<0.01)。根据配后16和24天两份乳样的乳脂孕酮含量诊断怀孕与未孕的准确率分别为78.9%(15/19)和100%(11/11)。