桑树Ca~(2+)/H~+反向转运体基因MCAX-1的克隆及序列与表达分析

植物体内的Ca2+/H+反向转运体在Ca2+介导的营养和信号转导中发挥着重要作用。选择桑树幼叶cDNA文库中功能注释为Ca2+/H+反向转运体基因(CAX)的一条EST序列设计引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)与反转录PCR(RT-PCR)在桑品种育71-1的幼叶中克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为MCAX-1(GenBank登录号:JN716318)。序列分析显示:MCAX-1全长1 784 bp,包括197 bp的5'端非翻译序列和243 bp的3'端非翻译序列,含有一个1 344 bp的完整ORF,编码447个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为47.93 kD,等电点为5.67。构建的桑树和其它植物基于CAX蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树与盐地碱蓬(Suaeda salsa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)等有较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑树幼芽、嫩叶、根和幼花中的表达量较高,在韧皮部、木质部和成熟果实中的表达量较低;MCAX-1在低温胁迫下的表达量减少,-1℃时几乎无表达,在干旱胁迫下的表达量随着胁迫时间延长逐渐达到最大值之后又迅速降低,在盐分胁迫初期的表达量无变化,但胁迫18 d时表达量明显降低。初步推测MCAX-1与桑树的抗逆性能有一定关联。     

桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。     

桑树花青素合成酶(ANS)基因的克隆及在2种果色桑树中的表达特征

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。从广东桑品种粤椹大10中克隆得到一条ANS序列,其ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为41 kD,等电点为5.62,具有2-酮戊二酸双加氧酶的保守结构域。多重序列比对表明物种间的ANS序列高度保守,系统进化树中桑树ANS与芍药科、芸香科、葡萄科等植物的同源序列聚在一个类群上。RT-PCR检测桑树ANS在结紫色果的粤椹大10的幼叶和桑椹中特异性表达,并且随着果色加深其表达水平呈上升趋势,而在结白色果的桑品种珍珠白的幼叶和桑椹中检测不到ANS的表达,暗示桑树ANS在桑椹的颜色形成中起到重要作用。     

桑树橡胶延伸因子基因的克隆与表达分析

桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp,编码252个氨基酸残基,将该基因命名为桑树橡胶延伸因子基因(GenBank登录号:GQ466080)。为探究该基因的功能,通过RT-PCR的方法分析该基因在桑树不同组织器官的表达,结果表明该基因在桑树幼叶中的表达量最高,其次是茎和芽,在根中的表达量最低。对桑树叶片进行细胞分裂素处理,发现细胞分裂素处理后该基因表达量有减少的趋势,在细胞分裂素处理的叶片中,正在伸展的幼叶中该基因的表达量要高于刚出现的幼叶和成熟叶。与桑树中已知的其它功能基因相比,桑树橡胶延伸因子在桑树正常生长中的表达量远高于桑树Na+/H+逆向转运蛋白基因MaNHX和桑树抗冻蛋白基因WAP27的表达量。从以上结果初步推测桑树橡胶延伸因子基因在桑树的生长发育中起重要作用。     

香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2的克隆及表达特性分析

获得香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2全长序列并初步探讨MaTPS2基因在植物逆境中的作用。在获得MaTPS2基因全长序列的基础上,采用同源序列比对、聚类分析、实时定量PCR等技术初步探讨香蕉MaTPS2基因的功能。从香蕉A基因组中获得一条3277bp MaTPS2全长序列,包含一个完整的开放阅读框1344bp,编码蛋白含447个氨基酸。其氨基酸理化性质分析表明,MaTPS2蛋白属于不稳定疏水性蛋白,具有一个结构域GT1-TPS。通过与已知植物的TPS氨基酸同源序列比对,同源性达77.95%。系统发育树进化关系分析表明MaTPS2编码的氨基酸序列与银杏TPS氨基酸序列（AAX16014.1）邻近,说明二者的亲缘关系较近。器官特异性分析表明MaTPS2在香蕉植株的根、球茎、假茎、叶、花各器官中均有表达,其中在球茎、假茎和叶中表达量较多,在果实中表达量较低。在ABA、干旱、盐害和枯萎病胁迫处理下MaTPS2表达量升高,在ACC胁迫处理下,MaTPS2表达量显著下降,而低温胁迫条件下,MaTPS2表达不响应。由此推导,MaTPS2可能参与调控香蕉抗旱、抗病机制。激素ACC和ABA胁迫处理说明MaTPS2的表达可能受激素蛋白间接调控。     

桑树光合系统Ⅰ psaE基因的克隆及表达分析

利用桑树(MorusL.)表达序列标签(EST),采用RT-PCR方法克隆了桑树光合系统Ⅰ(PSⅠ)psaE基因的全长cDNA序列,命名为MpsaE(GenBank登录号:GU645972)。序列分析表明,该基因序列全长705bp,存在97bp的5′端非翻译区和170bp的3′端非翻译区,其开放阅读框(ORF)长438bp,编码含有146个氨基酸的蛋白,预测蛋白分子质量为15.38kD,等电点为8.08。同源性分析表明,MpsaE编码蛋白与柑桔(Citrus sinensis)、毛果杨甙(Populus trichocarpa)和欧美杨(Populus eu-ramericana)psaE基因编码的蛋白具有较高的同源性,相似性达到98%。基于MpsaE与其它18个物种的psaE基因编码氨基酸序列构建的系统进化树显示,桑树与柑桔、蓖麻(Ricinus)、毛果杨甙和欧美杨的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MpsaE基因mRNA在桑树不同组织及部位的转录水平有明显差异:在叶片中的转录水平较高,其中幼叶(刚展开的第1片叶)和中部叶片(8-10位叶)的转录水平最高,其次为上部叶片(2-3位叶)、顶芽和下部叶片;在根部的转录水平最低。初步推测MpsaE基因是桑树PSⅠ参与某些光合生理反应的一个亚基。     

不同生育期干旱对紫花苜蓿生长和根系ABA含量的影响

为了探索紫花苜蓿(Medicago sativa L.)对干旱胁迫的响应机制,本研究通过温室栽培试验探索了3个品种紫花苜蓿在不同生育期对干旱胁迫的形态和生理响应。结果表明:紫花苜蓿在不同生育期对干旱胁迫的响应比较一致,但是不同品种间存在差异。综合紫花苜蓿的3个生育期,‘敖汉’和‘中苜1号’紫花苜蓿的地上生物量受干旱胁迫影响较大,对干旱胁迫响应迅速;‘三得利’的地上生物量对轻度干旱胁迫无明显响应,对中度或重度干旱有一定的响应。‘敖汉’和‘中苜1号’紫花苜蓿的根冠比对干旱胁迫的响应比‘三得利’要灵敏,‘敖汉’苜蓿根冠比增加最显著;花期3个品种紫花苜蓿的根冠比以及根冠比增加幅度均为3个生育期中最大。在3个生育期干旱胁迫下‘敖汉’和‘中苜1号’根系ABA含量均呈升高趋势;分枝期干旱胁迫下‘三得利’根系ABA含量也呈升高趋势,但在花期和结荚期其根系ABA含量对干旱胁迫的响应滞后。     

赖草Fe－SOD EST序列的克隆及分析

利用根际水分胁迫、脱落酸（ABA）和聚乙二醇（PEG）三种不同诱导方式,从干旱胁迫前后的赖草叶组织中提取RNA,通过RT-PCR方法获得单一片段,PCR产物经胶回收直接测序。测序结果表明,所得到的赖草EST序列长207bp,其编码的60个氨基酸与多种植物Fe-SOD氨基酸序列的同源性达到60％以上。     

ACC氧化酶基因在桑树水分和盐胁迫条件下的表达研究

为从分子水平上理解桑树在逆境胁迫中的应答机制,研究利用简并引物和RACE方法克隆了桑树氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因部分序列,并初步分析了该基因在水分胁迫和盐胁迫下的表达模式。结果表明:克隆得到的桑树ACC氧化酶基因编码区与其它植物ACC氧化酶基因的同源性很高,与蔷薇科李属植物相似性高达85%~86%;该基因在水分胁迫下表达量增加,但个体之间表达量有差异,推测可能与个体抗旱性差异有关;在盐胁迫下,ACC氧化酶表达量变化不明显,同一桑树幼苗不同叶位之间有差异,推测是盐害引起组织死亡导致表达量发生变化,而非盐胁迫直接诱导,个体之间耐盐性的差异以及不同发育阶段的叶片对盐害的敏感程度不同,表达量变化也不同。     

大蒜芥Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)的克隆及表达分析

Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物渗透胁迫下脯氨酸合成谷氨酸的关键酶。利用RACE结合RT-PCR技术克隆获得大蒜芥(Sisybrium altissimum)SaP5CS1基因全长cDNA序列,该基因全长1 907bp,其中开放阅读框为1 719bp,编码573个氨基酸,预测编码蛋白质的等电点为4.95,分子量为156.279kDa。同源分析显示,SaP5CS1与甘蓝型油菜(Brassica napus)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的蛋白序列相似性分别为98%和96%。实时荧光定量PCR分析表明,在干旱逆境胁迫条件下,大蒜芥SaP5CS1基因在根和叶的相对表达量受胁迫的诱导均上调。SaP5CS1基因的克隆及序列分析将为其功能分析和分子育种奠定基础。     

桑树转录因子CBF1基因的克隆及序列特征与低温应激表达

CBF(C-repeat binding factor)是一类与植物抗逆应答相关的转录因子。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树CBF1基因的全长cDNA序列,命名为MCBF1(GenBank登录号:JX186750)。该基因序列全长1 134 bp,包括693 bp的开放阅读框,87bp的5'端非翻译区和354 bp的3'端非翻译区;预测其编码的氨基酸序列具有保守的AP2结构域,且该结构域的两端拥有CBF家族特有的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR,与其它植物CBF1的序列相似性较高;基于CBF1序列的系统进化树显示桑树与柑橘(Citrus jambhiri)、垂枝桦(Betula pendula)和切花月季(Rosa hybrid cultivar)的亲缘关系较近。将构建的pET28a-MCBF1原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MCBF1重组蛋白分子质量大小与预测值一致。半定量RT-PCR分析MCBF1基因在未经过低温处理的对照桑苗幼叶中无表达,而在低温处理后的桑苗幼叶中有表达,其中低温处理4 d后的表达量最高。克隆的MCBF1基因编码蛋白质具有典型的CBF家族结构域,并具有低温诱导表达的特点,推测其在桑树对低温的耐受性中发挥作用。     

结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

桑树ASR基因的克隆及表达特征分析

ASR(ABA-stress-ripening)基因家族广泛参与植物对逆境胁迫的响应过程,并对植物的生长发育及果实成熟等起着重要调控作用。根据川桑(Morus notabilis)基因组数据库中的ASR基因序列设计引物,在杂交桑品种桂桑优62的幼苗中克隆得到一个ASR基因,命名为Ma ASR(Gen Bank登录号:KP636800.1)。Ma ASR编码区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白质等电点5.20,分子质量32.18 k D。以果叶兼用多倍体桑品种嘉陵40号不同发育成熟期的桑椹为材料,通过实时荧光定量PCR分析显示Ma ASR在果实成熟发育早期的表达量较高,在后期的表达量较低。以桂桑优62幼苗为材料进行实时荧光定量PCR分析的结果表明:Ma ASR在茎和叶中的表达量较高,在根部的表达量最低;幼苗经脱落酸(ABA)、甘露醇处理后根部的Ma ASR表达水平上调,经钨酸钠处理抑制了Ma ASR在根和叶中的表达,经蔗糖与葡萄糖处理使Ma ASR在根和叶中的表达水平上调。推测Ma ASR基因参与桑树果实发育和成熟的调控以及幼苗的生长发育,而且能够响应ABA和甘露醇以及糖类等非生物因子的诱导。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

天冬酰胺合成酶B(asparagine synthetase,AS-B;EC 6.3.5.4)参与植物氮同化过程的催化与调节。在构建的盐胁迫下桑树(Morus L.)抑制消减杂交(SSH)文库中发现一个编码天冬酰胺合成酶的基因片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得2 061 bp的全长序列,完整的开放读码框(ORF)长1 761 bp,编码586个氨基酸,预测蛋白分子质量65.66 kD,将该基因命名为桑树天冬酰胺合成酶基因(MaAS,GenBank登录号:HQ025955)。序列分析显示,MaAS编码的蛋白包括2个保守的功能域(谷氨酰胺-氨基转移结构域和合成酶结构域),与其它植物天冬酰胺合成酶的氨基酸序列相似性在75%以上。将MaAS基因开放读码框连接到pET28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MaAS重组蛋白分子质量大小与预测的分子质量一致。采用邻接法构建的桑树和其它植物基于MaAS蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树、葡萄(Vitis vinif-era)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)聚为一类,亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MaAS基因在桑树不同部位的转录水平存在明显差异,在盛花期的雌花中转录水平最高,尚未木质化的幼根和成熟桑椹中的转录水平较高,幼茎的茎皮和木质部中的转录水平较低,嫩叶中的转录水平很低,腋芽中的转录水平最低。     

盐分胁迫对桑树叶片中渗透调节物质含量的影响

以农桑14号、昂绿1号、湖桑32号、鲁插1号4个桑树品种的2年生嫁接苗为试验材料,研究以不同浓度盐分胁迫不同时间后桑树叶片内渗透调节物质含量的变化。在盐分胁迫下,4个桑树品种叶片中的脯氨酸及可溶性糖和可溶性蛋白含量的变化呈现一定规律性,且品种间具有显著差异。4个桑树品种叶片中的脯氨酸含量在各种浓度盐分胁迫初期都迅速增加,但高浓度盐分胁迫后期叶片中的脯氨酸含量在品种间表现出显著差异;可溶性糖含量的变化在各种浓度盐分胁迫期间都表现出先升高后降低的趋势,但各个品种下降的时期不同;可溶性蛋白含量随盐分胁迫的持续不断降低,但湖桑32号和鲁插1号叶片中的可溶性蛋白含量在高浓度盐分胁迫后期略有升高。以上结果提示:在桑树对盐分胁迫的响应过程中,叶片中的渗透调节物质可能起到一定的调节作用,而不同品种间表现出的差异性可能与品种的抗盐能力有关。     

蒙农杂种冰草AcdMYB1基因克隆及表达分析

‘蒙农杂种’冰草(Agropyron cristatum×A.desertorum‘Hycrest-Mengnong’)具有干草产量高，适口性好，抗逆性强的特点，是中国北方干旱地区建立人工草地的适宜草种。本研究利用同源克隆方法从‘蒙农杂种’冰草中克隆得到的1个MYB类转录因子基因(命名为AcdMYB1),对其进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明：该基因cDNA序列长度为1 161 bp,包含完整开放阅读框(ORF)为969 bp,编码322个氨基酸，具有MYB转录因子的保守结构域。AcdMYB1与小麦族的山羊草、普通小麦、野生二粒小麦的同类基因亲缘关系最近，序列一致性均在90%以上。组织表达中AcdMYB1基因在穗中的表达量最高，其次为叶、根，茎中表达量最低；在模拟自然干旱胁迫下，能够显著降低AcdMYB1的表达水平。烟草亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞核。本研究为进一步探索‘蒙农杂种’冰草AcdMYB1基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)为研究材料,利用同源序列法克隆得到1个DREB3类转录因子基因,命名为MwDREB3,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析MwDREB3 基因的表达特征,为蒙古冰草优异抗性基因的挖掘和利用提供理论依据.结果表明:该基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框,长度为774bp,编码257个氨基酸,该蛋白近5'端含有1个保守的AP2结构域.系统进化树分析表明MwDREB3 编码的蛋白与小麦(Triticum aestivum)的DREB、山羊草(Aegilops columnaris)DRF1的进化关系较近.该基因在干旱、高盐、ABA诱导条件下,表达量上调;在低温条件下,表达量下调.     

西伯利亚白刺肌动蛋白基因的分离与特性分析

利用兼并PCR及RACE技术克隆了西伯利亚白刺的肌动蛋白基因(Nitraria sibirica Actin, NsAct),并对其基因结构和表达特性进行了分析。所克隆的NsAct cDNA全长序列为1 831 bp,包含1 134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸;基因组DNA全长序列为2 913 bp,包含5个外显子和4个内含子。系统进化分析结果显示,NsAct与其他植物的肌动蛋白基因具有较高的同源性,与芒果(无患子目)亲缘关系最为接近。基因表达特性分析的结果显示,该基因在根、茎、叶中的表达量基本一致;在干旱、盐、低温及外源脱落酸胁迫下,表达量无明显变化,这些结果验证了该基因作为分子内标的可靠性。