桑树Ca~(2+)/H~+反向转运体基因MCAX-1的克隆及序列与表达分析

植物体内的Ca2+/H+反向转运体在Ca2+介导的营养和信号转导中发挥着重要作用。选择桑树幼叶cDNA文库中功能注释为Ca2+/H+反向转运体基因(CAX)的一条EST序列设计引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)与反转录PCR(RT-PCR)在桑品种育71-1的幼叶中克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为MCAX-1(GenBank登录号:JN716318)。序列分析显示:MCAX-1全长1 784 bp,包括197 bp的5'端非翻译序列和243 bp的3'端非翻译序列,含有一个1 344 bp的完整ORF,编码447个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为47.93 kD,等电点为5.67。构建的桑树和其它植物基于CAX蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树与盐地碱蓬(Suaeda salsa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)等有较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑树幼芽、嫩叶、根和幼花中的表达量较高,在韧皮部、木质部和成熟果实中的表达量较低;MCAX-1在低温胁迫下的表达量减少,-1℃时几乎无表达,在干旱胁迫下的表达量随着胁迫时间延长逐渐达到最大值之后又迅速降低,在盐分胁迫初期的表达量无变化,但胁迫18 d时表达量明显降低。初步推测MCAX-1与桑树的抗逆性能有一定关联。     

桑树半乳糖激酶基因的克隆及序列特征与诱导表达分析

从已构建的桑树幼叶cDNA文库得到一条编码桑树半乳糖激酶(galactokinase)的基因序列片段,通过RT-PCR和RACE获得该基因的完整序列,命名为M-GALK(GenBank登录号:JQ041908)。该基因全长1 400 bp,存在53 bp的5’端非翻译序列(5’-UTR)和51 bp的3’端非翻译序列(3’-UTR),其ORF长1 296 bp,编码431个氨基酸,预测蛋白质分子质量为47.07kD,等电点为6.34。同源性分析表明,M-GALK与葡萄和蓖麻等物种的GALK序列之间具有很高的保守性。基于桑树和其它物种GALK序列的系统进化分析表明,桑树与葡萄、蓖麻、杨毛果的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测M-GALK在桑树不同部位的表达存在一定的差异性,在幼芽、幼嫩叶和幼花中的表达量较高,在根和成熟桑椹中的表达量较低。在低温、盐分、干旱胁迫下和脱落酸(ABA)诱导处理后,桑树幼叶中M-GALK的表达量均发生明显变化:低温胁迫下,M-GALK的表达量在一开始有所减少,但是随着温度逐渐降低,表达量明显增加;干旱胁迫下,M-GALK的表达量逐渐增加,在9 h达到最高后又逐渐恢复到正常水平;盐分胁迫下,M-GALK的表达量先降低后又逐渐增加并保持基本不变,在8 d后又逐渐恢复到正常水平;ABA诱导下,M-GALK的表达量逐渐增加,在24 h达到最高之后又逐渐恢复到正常水平。推测M-GALK可能与桑树的抗逆性有关。     

桑树转录因子CBF1基因的克隆及序列特征与低温应激表达

CBF(C-repeat binding factor)是一类与植物抗逆应答相关的转录因子。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树CBF1基因的全长cDNA序列,命名为MCBF1(GenBank登录号:JX186750)。该基因序列全长1 134 bp,包括693 bp的开放阅读框,87bp的5'端非翻译区和354 bp的3'端非翻译区;预测其编码的氨基酸序列具有保守的AP2结构域,且该结构域的两端拥有CBF家族特有的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR,与其它植物CBF1的序列相似性较高;基于CBF1序列的系统进化树显示桑树与柑橘(Citrus jambhiri)、垂枝桦(Betula pendula)和切花月季(Rosa hybrid cultivar)的亲缘关系较近。将构建的pET28a-MCBF1原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MCBF1重组蛋白分子质量大小与预测值一致。半定量RT-PCR分析MCBF1基因在未经过低温处理的对照桑苗幼叶中无表达,而在低温处理后的桑苗幼叶中有表达,其中低温处理4 d后的表达量最高。克隆的MCBF1基因编码蛋白质具有典型的CBF家族结构域,并具有低温诱导表达的特点,推测其在桑树对低温的耐受性中发挥作用。     

桑树光合系统Ⅰ psaE基因的克隆及表达分析

利用桑树(MorusL.)表达序列标签(EST),采用RT-PCR方法克隆了桑树光合系统Ⅰ(PSⅠ)psaE基因的全长cDNA序列,命名为MpsaE(GenBank登录号:GU645972)。序列分析表明,该基因序列全长705bp,存在97bp的5′端非翻译区和170bp的3′端非翻译区,其开放阅读框(ORF)长438bp,编码含有146个氨基酸的蛋白,预测蛋白分子质量为15.38kD,等电点为8.08。同源性分析表明,MpsaE编码蛋白与柑桔(Citrus sinensis)、毛果杨甙(Populus trichocarpa)和欧美杨(Populus eu-ramericana)psaE基因编码的蛋白具有较高的同源性,相似性达到98%。基于MpsaE与其它18个物种的psaE基因编码氨基酸序列构建的系统进化树显示,桑树与柑桔、蓖麻(Ricinus)、毛果杨甙和欧美杨的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MpsaE基因mRNA在桑树不同组织及部位的转录水平有明显差异:在叶片中的转录水平较高,其中幼叶(刚展开的第1片叶)和中部叶片(8-10位叶)的转录水平最高,其次为上部叶片(2-3位叶)、顶芽和下部叶片;在根部的转录水平最低。初步推测MpsaE基因是桑树PSⅠ参与某些光合生理反应的一个亚基。     

白羊草NAC转录因子基因的克隆及表达分析

NAC转录因子是植物特有的转录因子并在植物的生长发育过程中发挥重要的作用,根据其他植物NAC转录因子基因的氨基酸保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE技术从白羊草(Bothriochloa ischaemum)中获得了全长cDNA,命名为BiNAC.序列分析表明,该cDNA片段全长为1549 bp,开放阅读框1125 bp,编码374个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征.进化树分析表明,该蛋白属于ATAF亚族,与高粱(Sorghum bi-color)亲缘关系最近,同源性达到94％.Real-time PCR检测结果表明,BiNAC基因在茎中的表达量最高,根中表达量最少,并且受NaC1胁迫表达上调.同时成功构建了植物表达载体pBI121-BiNAC-GUS,为进一步开展NAC基因的功能研究创造了条件.     

桑树幼叶cDNA文库的构建及部分表达序列标签分析

基于为鉴定和克隆桑树功能基因提供基础信息的目的,采用RNA转录5′末端转换(SMART)法构建了桑树幼叶全长cDNA文库。该文库容量为1.02×106pfu/mL,重组率95%,符合构建基因文库的质量要求。从构建的桑树幼叶cDNA文库中随机挑取48个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为32条,经UniGene数据库归并后为32条,UniGene比率为100%;与NCBI核酸数据库进行比对、查询和注释,在32条序列中有29条序列具有同源性,其中16条为全长序列,完整性比率为55.2%;初步发现具有已知功能基因的ESTs 6个,具有推测功能基因的ESTs 5个,未命名或未知功能基因的ESTs 21个。     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。     

普陀山苔草植物络合素合成酶CpPCS基因克隆及其在叶中的表达分析

以超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为材料,克隆其植物络合素合酶基因CpPCS的cDNA全长序列。同时,对其进行重金属胁迫处理,研究该基因在叶中的表达特点。结果表明,该基因cDNA序列全长1 461bp,可编码486个氨基酸;与其它植物同源基因对比显示,它们的氨基酸序列相似性在63%左右;通过构建进化树发现,普陀山苔草CpPCS与小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)及芦苇(Phragmites australis)等单子叶植物亲缘关系最近;荧光定量RT-PCR分析结果显示,CpPCS基因及CePCS基因受重金属铅锌胁迫上调表达,其中在叶中的表达量显著增加(P0.05)。通过普陀山苔草植物络合素合酶蛋白基因进行了克隆鉴定,探讨该基因的结构、进化关系及其参与普陀山苔草重金属胁迫的应答模式,为进一步培育重金属污染土壤修复的植物奠定基础。     

鸭Mef2bnb基因的克隆及其mRNA丰度在肌肉组织中的发育性表达变化

旨在克隆鸭肌肉增强因子2b邻居基因(Myocyte enhancer factor 2Bneighbor,Mef2bnb)的cDNA全序列,并对其进行分析,研究该基因在肌肉组织中的发育性表达规律。利用RACE技术从鸭腿肌中克隆出Mef2bnb的全长cDNA序列,应用Q-PCR技术检测了自鸭胚胎10d至出壳1周肌肉组织中Mef2bnb基因的发育性表达。结果显示:该序列全长935bp,包括5′非编码区(5′UTR)51bp和3′非编码区(3′UTR)518bp,完全开放阅读框(ORF)366bp,可编码121个氨基酸残基,结构分析表明,该肽链没有信号肽,第1～117号氨基酸为鸭Mef2bnb基因与其它动物高度保守的NEP结构域;Mef2bnb基因在胸肌、腿肌和心脏3种肌肉组织中不同阶段均有不同程度的表达,而其在胸肌中的表达量均高于同时期在腿肌中的表达量,推测鸭Mef2bnb基因可能具有促进Ⅱ型纤维形成的功能,另外该基因在心脏的高表达表明其可能与心脏的发育有关。本研究结果将为进一步研究鸭Mef2bnb结构及其在肌肉组织中的作用奠定基础。     

桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

天冬酰胺合成酶B(asparagine synthetase,AS-B;EC 6.3.5.4)参与植物氮同化过程的催化与调节。在构建的盐胁迫下桑树(Morus L.)抑制消减杂交(SSH)文库中发现一个编码天冬酰胺合成酶的基因片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得2 061 bp的全长序列,完整的开放读码框(ORF)长1 761 bp,编码586个氨基酸,预测蛋白分子质量65.66 kD,将该基因命名为桑树天冬酰胺合成酶基因(MaAS,GenBank登录号:HQ025955)。序列分析显示,MaAS编码的蛋白包括2个保守的功能域(谷氨酰胺-氨基转移结构域和合成酶结构域),与其它植物天冬酰胺合成酶的氨基酸序列相似性在75%以上。将MaAS基因开放读码框连接到pET28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MaAS重组蛋白分子质量大小与预测的分子质量一致。采用邻接法构建的桑树和其它植物基于MaAS蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树、葡萄(Vitis vinif-era)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)聚为一类,亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MaAS基因在桑树不同部位的转录水平存在明显差异,在盛花期的雌花中转录水平最高,尚未木质化的幼根和成熟桑椹中的转录水平较高,幼茎的茎皮和木质部中的转录水平较低,嫩叶中的转录水平很低,腋芽中的转录水平最低。     

斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段的克隆和序列分析

斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是桑树的主要害虫之一。昆虫体内的乙酰胆碱酯酶(AChE,EC3.1.1.7)是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。通过设计简并引物,利用RT-PCR技术克隆了斜纹夜蛾的乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段(GenBank登录号:FJ959384)。序列分析结果表明,该cDNA片段全长1 191 bp,编码397个氨基酸,包含了乙酰胆碱酯酶基因的特征位点区域。基于乙酰胆碱酯酶氨基酸同源序列的进化分析表明,斜纹夜蛾与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的亲缘关系最近,与棉蚜(Aphis gossypii)的亲缘关系最远。该基因cDNA片段的克隆有助于对斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶结构、功能及抗药性的分子机制研究。     

桑树苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC 4.3.1.5)是植物体内苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶,与植物的抗病性和植物体内黄酮类色素等多种次生物质的生物合成密切相关。利用同源克隆方法成功克隆了桑树苯丙氨酸解氨酶基因(pal)cDNA片段(GenBank登录号:FJ938356),该片段长1 105 bp,编码367个氨基酸,氨基酸序列的34-50区域为PAL的特征序列。桑树pal基因和其他植物pal基因的同源性分析表明其与甜樱桃的亲缘关系最近,同源性高达82%,与树莓的同源性达80%,与杨树和咖啡树也达到75%,由此也证实克隆的桑树cDNA片段为pal基因家族成员之一。     

家蚕泛素结合酶新基因的克隆与基因组结构及5′调控区分析

在家蚕丝腺cDNA文库测序过程中,发现一个编码家蚕泛素结合酶的EST序列,利用3′RACE方法克隆了一个新的家蚕泛素结合酶基因cDNA全长序列,命名为BmUCE2 I(GenBank登录号为DQ219874)。家蚕BmUCE2 I基因全长cDNA由465 bp的开放阅读框序列(ORF)、97 bp的5′端非翻译区序列(5-′UTR)和237 bp的3′端非编码区序列(3-′UTR)组成,其编码的154个氨基酸与其他真核生物间具有较高的同源性。利用BmUCE2 I的EST片断作探针,通过筛选家蚕噬菌体基因组文库,获得了家蚕BmUCE2 I基因组序列和5′调控序列。BmUCE2 I基因由4个外显子和3个内含子组成,在5′端上游调控区域没有类似TATA盒元件,但在-219~-268 bp的区域存在一个50bp的启动子序列,此外还存在CF2-Ⅱ、FTZ、DFD、BRCZ2、DL、STAT、PRD-HD等多个转录因子结合位点。家蚕泛素结合酶新基因的克隆、基因结构及5′调控区的分析为进一步研究泛素蛋白水解酶复合通路相关基因的调控规律提供了重要依据。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

桑树花青素合成酶(ANS)基因的克隆及在2种果色桑树中的表达特征

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。从广东桑品种粤椹大10中克隆得到一条ANS序列,其ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为41 kD,等电点为5.62,具有2-酮戊二酸双加氧酶的保守结构域。多重序列比对表明物种间的ANS序列高度保守,系统进化树中桑树ANS与芍药科、芸香科、葡萄科等植物的同源序列聚在一个类群上。RT-PCR检测桑树ANS在结紫色果的粤椹大10的幼叶和桑椹中特异性表达,并且随着果色加深其表达水平呈上升趋势,而在结白色果的桑品种珍珠白的幼叶和桑椹中检测不到ANS的表达,暗示桑树ANS在桑椹的颜色形成中起到重要作用。     

野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara的克隆与选择性剪接

昆虫的钠离子通道蛋白是许多神经毒性药物的作用靶标。根据家蚕钠离子通道蛋白基因(GenBank登录号:EU688970)序列设计引物,分段RT-PCR克隆了野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara(GenBank登录号:EU688972)。序列分析表明,Bmmpara基因的cDNA长5553bp,编码1851个氨基酸,与家蚕基因组序列比对,存在34个外显子,其中第2、22、27外显子存在选择性剪接。根据Bmmpara序列和家蚕基因组序列设计引物,采用PCR方法克隆到3段野桑蚕基因组序列,长度分别为1632、536和3220bp。进一步将Bmmpara编码氨基酸序列与野桑蚕基因组比对,发现有a(ENDLGRTKKKK)、b(GL-KAALCGRCVSS)、c(SLINFVAALCGAGGIQAFKTMRTLRALRPLRAMSRMQGMRV)3个选择性微外元,可能存在6种选择性剪接,构成野桑蚕钠离子通道蛋白不同亚型。