白桦扩展蛋白基因的克隆分析及植物表达载体构建

从白桦中分离了4条扩展蛋白家族基因全长c DNA序列和2条大于400 bp的部分c DNA序列,命名为Bp EXP1~Bp EXP5和Bp EXPL,其中4个全长c DNA推导蛋白氨基酸残基数为186~258个,编码蛋白的分子量为20.07~27.80 k Da,理论等电点为5.57~9.20。氨基酸序列分析结果表明:5个alpha-expansin序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有1个组氨酸功能域。利用Real time RTPCR分析EXP家族基因在白桦不同器官和组织内的表达模式,结果表明:6个EXP基因在白桦的不同器官和组织中有着不同的表达水平,其中Bp EXP1在分生木质部中表达量最高,推测其与木材形成过程的细胞壁修饰相关;Bp EXP3在发育的蒴果中表达量最高,推测其与果实和种子发育过程中的细胞壁修饰相关。最后选择Bp EXP1和Bp EXPL基因,构建了pROKⅡ-Bp EXP1和pROKⅡ-Bp EXPL植物表达载体。     

鹅VNN1基因的克隆及组织表达分析

[目的]Vanin是一种泛酰巯基乙胺酶,在脂类代谢中发挥重要作用。本试验目的是扩增鹅Vanin基因亚型(VNN1)基因的c DNA序列,检测VNN1基因在鹅不同组织中m RNA水平的表达规律。[方法]以太湖鹅(Anser anser)肝脏总RNA为模板,采用RT-PCR和快速扩增c DNA末端(RACE)方法克隆鹅VNN1基因全长c DNA序列,并运用多种生物信息学软件对其进行分析,应用实时荧光定量PCR(q PCR)技术检测VNN1基因在不同组织的表达情况。[结果]序列分析表明:鹅VNN1基因(Gen Bank登录号:KY399733)c DNA全长1 924 bp,包含1 476 bp的开放阅读框,35 bp的5'UTR和417 bp的3'UTR,共编码491个氨基酸。经预测鹅VNN1基因编码的蛋白质由7 646个原子组成,相对分子质量为54 870.61,理论等电点为5.23,是不稳定蛋白。在线预测发现鹅与鸭的VNN1蛋白三级结构呈现高度相似的螺旋和折叠。序列分析表明,鹅与绿头鸭的VNN1基因核苷酸及氨基酸同源性较高。系统进化树分析表明,鹅与绿头鸭亲缘关系较近。q PCR结果表明,鹅VNN1基因在肝脏的表达量显著高于小肠、肾、脾和肺(P0.01)。[结论]获得鹅VNN1基因的全长c DNA序列,该基因在肝脏中高表达。     

山核桃种子脂肪代谢期EST序列的初步分析

山核桃Carya cathayensis为重要的油料干果树种,其非同一般的高含油率必定有其特殊的成油机制。为探索其成油机制,在已构建的山核桃脂肪代谢相关c DNA文库基础上,对c DNA进行随机克隆测序,对序列进行拼接、功能注释,基因本体论(gene ontology,GO)分类及基于拟南芥Arabidopsis thaliana的Fun Cat分类,并对与脂肪代谢相关的全长c DNA序列进行蛋白性质分析。结果共得到1 010条山核桃表达序列标签(ESTs),经拼接获得188个编码蛋白质的基因(unigene),其中92个contigs和96个singlets。GO分类将这些unigene分成细胞组分、分子功能和生物过程等3类,并发现各序列编码的基因并不承担单一的功能,有些序列在功能上有重叠;同时参照拟南芥的基因功能分类,将unigene序列在功能上分成9类,得到了143个全长c DNA序列,其中包括14个与脂肪代谢相关的c DNA序列。对12个与脂肪代谢相关的全长c DNA序列进行蛋白性质分析,发现它们均具有磷酸化位点;除油质蛋白外都没有跨膜区域,且不具信号肽结构,为非分泌蛋白,属于某个蛋白家族;不同的油体蛋白具有不同的跨膜区,且均具有信号肽结构,属于Oleosin super family蛋白家族。表4参35     

凤丹牡丹ANS(PoANS)基因克隆、特性及表达

通过RT-PCR技术,从凤丹牡丹花瓣中克隆出编码ANS基因的c DNA序列,并对其进行生物信息学分析。对不同开花阶段的凤丹花瓣进行实时荧光定量及总花青素质量分数测定,构建原核表达载体PET-28aANS,并转化大肠杆菌BL21感受态,经IPTG诱导进行体外表达。结果表明:该序列编码区域共1 065 bp,编码354个氨基酸,其蛋白相对分子质量为40 475.5,亚细胞定位为细胞质的可能性最大;表达分析显示,ANS基因表达水平与不同开花时期的总花青素质量分数及花色相关,原核表达得到相对分子质量约为44 000的ANS-His-tag融合蛋白,与预测蛋白大小相一致。     

山葡萄DFR基因全长cDNA的克隆与序列分析

应用RT-PCR和SMART RACE等技术克隆山葡萄二氢黄酮醇4-还原酶基因的全长c DNA序列,结果表明,该基因全长1 362 bp,包括1 014 bp的完整开放阅读框,推测其编码337个氨基酸。该基因表达产物相对分子质量为37.50 ku,等电点为5.95,是稳定蛋白,不包含信号肽。蛋白质疏水性分析结果表明,DFR疏水性最大值为2.511,最小值为-2.267,平均值为-0.146,整体表现为亲水性。二级结构分析结果表明,DFR的二级结构主要以α-螺旋(35.31%)和不规则卷曲(46.29%)为蛋白最大量的结构元件。对不同植物DFR氨基酸序列进行多重比对发现,同源性较高,DFR与NADPH结合区域和底物结合区域都表现出高度保守。用推导的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同源性比较,其氨基酸序列与欧亚种葡萄、大豆、矮牵牛等植物的DFR氨基酸序列两两比对的相似性系数分别为98%、76%、74%。     

茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB克隆及表达分析

【目的】花色苷是一类通过类黄酮途径合成的水溶性次生代谢产物,既能使植物的不同器官呈现红、紫、蓝等颜色,还有利于人体健康。紫茄富含花色苷,但是有关茄萼花色苷生物合成的分子机制还不是很清楚。本研究旨在通过克隆茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB,测定其在不同发育时期不同颜色茄萼中的表达量,探究DFR和MYB在茄萼花色苷合成中的作用。【方法】选用绿萼和紫萼长茄(Solanum melongena L.)果萼为试材,测定不同p H条件下茄萼花色苷含量;通过RACE方法分离克隆DFR和MYB cDNA全长序列,分析DFR和MYB的保守结构域及序列特征;分别对DFR和MYB及其同源蛋白序列进行系统进化分析,构建系统进化树来进一步分析鉴定基因;使用Ex PASy网站提供的在线分析软件SOPMA预测蛋白质二级结构;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在不同发育阶段果萼中的表达情况。【结果】从绿萼和紫萼长茄果萼中克隆了DFR和MYB片段,分别命名为ouSmDFR、dongSmDFR和ouSmMYB、dongSmMYB,Gen Bank登录号分别为:KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。ouSmDFR和dongSmDFR全长分别为1 285 bp和1 249 bp,开放阅读框为858 bp和864 bp,分别编码285个和287个氨基酸;ouSmMYB和dongSmMYB全长分别为969 bp和959 bp,开放阅读框均为462 bp,编码153个氨基酸。蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲均为两个DFR蛋白和两个MYB蛋白的主要二级结构元件。序列比对表明DFR蛋白具有NADPH结构域(NADPH binding domain)和底物特异性结合结构域(Substrate specific binding domain),属于NADB-Rossmann超基因家族;MYB蛋白属于R2R3-MYB转录因子,具有R2、R3两个MYB结构域和b HLH结合域。ouSmDFR和dongSmDFR与St DFR和Sl DFR具有相对较高的同源性;ouSmMYB和dongSmMYB与Es MYB同源性较高。花色苷含量测定显示,紫萼果茄萼花色苷含量较高且随着果实的发育成熟而逐渐增加;而绿萼茄萼几乎检测不到花色苷。荧光实时定量PCR分析表明,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达量均远高于绿萼长茄;从初蕾期到盛花期,紫萼长茄果萼中DFR和MYB表达量逐渐升高,而绿萼长茄则几乎没有变化,与两个品种茄萼颜色变化相一致。【结论】ouSmDFR和dongSmDFR属于NADB-Rossmann超基因家族,ouSmMYB和dongSmMYB为典型R2R3-MYB转录因子,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达明显高于绿萼长茄。推测DFR和MYB在茄萼呈色中发挥作用,并且参与花色苷生物合成。     

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因的克隆与原核表达

以蒺藜苜蓿(Medicargo trunctula)幼果为试材,采用RT-PCR方法克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA片段.该片段全长1 018bp,与GenBank中已注册的DFR基因同源性为99.8%,编码334个氨基酸;构建DFR基因原核表达载体pETDFR,DFR在原核表达系统中得到了高效表达,获得预期大小(38.1ku)的酶蛋白分子.原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致.     

大丽花花瓣衰老相关蛋白DpXTH1及其编码基因的分离（英文）

[目的]为了探讨乙烯非敏感型花卉衰老相关的分子机理。[方法]以大丽花花瓣为材料,利用双向电泳、质谱分析及分子生物学技术,分离、鉴定花瓣衰老相关蛋白质及其编码基因。[结果]从大丽花透色期、盛花期和衰败期花瓣蛋白质的双向电泳图谱中,检测到44个表达量差异在2倍以上的蛋白质斑点,从中分离、鉴定了木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase,XTH),其表达量随花瓣的衰老进程而持续增加,属于一种衰老相关蛋白质。以大丽花花瓣RNA为材料,设计一对简并引物,通过RTPCR技术克隆了大丽花花瓣XTH基因的c DNA序列,其编码区序列全长882 bp,编码293个氨基酸残基(基因登录号HM053613.1,命名其为Dp XTH1)。聚类分析表明,Dp XTH1氨基酸序列与其他植物的XTH具有较高的同源性。[结论]分离、鉴定的大丽花Dp XTH1属于植物XTH家族,其生物学功能与大丽花花瓣的衰老进程及调控有关。     

马铃薯NF-YA转录因子基因的克隆及生物信息学分析

NF-Y类转录因子是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物,通过与特异性的于启动子区原件结合来调节目的基因的表达。本研究在马铃薯中克隆得到NF-YA基因的全长c DNA序列,其全长c DNA序列为1 076 bp,591 bp的开放阅读框编码一个196个氨基酸的蛋白质,分子量为22.06 k Da,等电点为10.06;该基因序列的分子量、等电点及预测的蛋白质的长度与已报道拟南芥、水稻、玉米和番茄中NF-YA转录因子家族成员极为相似。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

高羊茅FaSRP基因克隆及在非生物胁迫下表达分析（英文）

[目的]了解高羊茅SRP基因结构与功能以及在多种逆境胁迫下的表达变化。[方法]以高羊茅转录组学测序获得的SRP序列为基础,从高羊茅叶片c DNA中应用3’RACE和5’RACE方法扩增出SRP基因全长c DNA序列。[结果]SRP基因c DNA全长为1 165bp,具有一个完整的长度为855 bp的开放阅读框,编码蛋白为284个氨基酸,包含一个REF结构域。通过生物信息学的方法预测SRP基因的结构及功能发现,Fa SRP与单子叶植物SRP蛋白具有相对较高的序列同源性。应用荧光定量PCR技术分析了SRP基因在低氮、干旱、高热以及高盐逆境胁迫下的表达变化发现SRP基因能够应答低氮、干旱、高温等胁迫,但应答机制不一样,可能是通过不同途径调节植物抗逆性,Fa SRP对高盐胁迫不敏感。[结论]该研究为培育抗旱、耐热、营养高效的高羊茅品种提供候选基因与技术储备。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

割手密铜锌超氧化物歧化酶基因(SsSOD-1a)的克隆与分析

本文以高粱超氧化物歧化酶基因(NCBI登录号为XM 002445626.1)c DNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,通过分子克隆和序列分析验证,获得了1个割手密铜锌超氧化物歧化酶基因全长c DNA序列(Ss SOD-1a,Gene Bank登录号为KJ002571)。序列全长703 bp,由624 bp的开放读码框,36 bp的5’非翻译区和43 bp的3’非翻译区组成,编码207个氨基酸。氨基酸保守结构域分析表明,该蛋白序列具有铜锌超氧化物歧化酶保守结构域,属于SOD家族。氨基酸同源性分析发现,割手密Ss SOD-1a蛋白序列与鹰嘴豆、高粱、玉米等物种同源关系较近。     

莱茵衣藻CrPGP3 和CrFAT1 基因克隆及其序列分析与原核表达

克隆莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的CrPGP3和CrFAT1基因,并对其序列进行生物信息学分析和原核表达。选取莱茵衣藻CC124提取总RNA后,反转录c DNA,PCR获得CrPGP3和CrFAT1的全长编码区,构建原核表达载体CrPGP3-PGEX-6p-1和CrFAT1-PGEX-6p-1,转入大肠杆菌DL21(DE3)中,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导整合蛋白表达。结果表明,CrPGP3和CrFAT1的全长编码区分别为786 bp和1 188 bp,分别编码261和395个氨基酸;CrPGP3是与脂类合成相关磷脂酰甘油磷酸合成酶(Phosphatidylglycerophosphate synthase)属于CDP-alcohol phosphatidyltransferase家族,CrFAT1是酰基载体蛋白硫脂酶(Acyl-ACP thioesterase)属于hot dog家族;SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。本文成功克隆了CrPGP3和CrFAT1基因的全长编码区,并在原核生物中表达得到了预期蛋白。     

茶树CsSMT基因的克隆、原核表达及植物超表达载体构建

为了发掘利用茶树(Camellia sinensis)富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(Selenocysteine methyltransferase,SMT)基因Cs SMT,基于宁州2号转录组测序结果,通过RACE克隆该基因的c DNA全长,并通过原核表达和蛋白质印迹(Western blotting)验证该基因,然后构建超表达载体,转化至根癌农杆菌。结果表明:该基因c DNA全长为1277 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1 050 bp,与NCBI公布的茶树该基因ORF序列有8个点突变,且缺少GTCGTC序列。Cs SMT基因编码349个氨基酸,其氨基酸序列与毛果杨、野生大豆、黄芪的SMT以及川桑的同型半胱氨酸-S-甲基转移酶2(Homocysteine-S-methyltransferase 2,HMT2)的氨基酸序列有较高的相似性。目标蛋白分子量约38 k Da,为水溶性蛋白,与预测结果相符。成功构建Cs SMT基因的超表达载体,并获得携带Cs SMT的农杆菌菌株。     

荷花B类MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表达分析

以荷花品种'重瓣一丈青'(Nelumbo nucifera‘chongban yizhangqing')为试材,采用同源克隆方法获得2个AP3/DEF同源基因NnDEF1和NnDEF2。NnDEF1基因CDS序列全长678 bp,编码225个氨基酸;NnDEF2基因CDS序列全长693 bp,编码230个氨基酸;2个蛋白的C-末端序列均包含典型的PI衍生基序和PaleoAP3基序。序列比对和系统进化分析表明:NnDEF1和NnDEF2基因属于B功能基因家族AP3/DEF亚家族,2个基因序列的同源性远高于其他物种同源基因,表明荷花进化中可能存在基因加倍事件。表达模式分析显示:NnDEF1和NnDEF2基因表达具有品种间相似性和个体内差异性,NnDEF1倾向于在花瓣和雄蕊组织中表达,在内侧花瓣表达量最高;而NnDEF2则表达较广泛,在茎、叶、萼片、花瓣组织中均有表达,在外轮花瓣组织中表达量最高。基因表达差异表明,NnDEF1基因可能在荷花瓣化现象中发挥作用。上述研究结果可为研究荷花花发育及瓣化现象分子机制奠定基础。     

龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达

【目的】克隆龙眼Dimocarpus longan己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因,并对其进行生物信息学分析及原核表达分析.【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得基因全长c DNA序列,构建p ET-32a-Dl HXK原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中诱导表达.【结果和结论】成功克隆龙眼己糖激酶基因的c DNA全长序列,命名为Dl HXK,登录号为KF776906.1.龙眼Dl HXK序列全长2 101 bp,包括1个1 488 bp的开放阅读框,预测编码495个氨基酸;进化树和相似性分析发现,该基因与温州蜜柑Citrus unshiu的相似性最高,达到了82%;荧光定量表达分析表明,Dl HXK基因随着果实的发育成熟表达量逐渐上升;经IPTG诱导和SDSPAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白大小相吻合.由此可见,利用RT-PCR结合RACE方法成功克隆了龙眼的己糖激酶基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中获得高效表达.     

红白忍冬花青素合酶编码基因rLjANS1的克隆、表达分析及其与花色苷积累的关系

花青素合成酶是植物花青素合成途径中的关键酶,为了探究花青素合成酶编码基因在红白忍冬花色苷合成中的作用,在分析忍冬、红白忍冬转录组数据的基础上,用逆转录PCR(RT-PCR)技术从红白忍冬中分离得到1个编码花青素合成酶基因的全长cDNA序列,将其命名为rLjANS1。测序结果表明,该基因的开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸。生物信息学分析结果显示,rLjANS1编码蛋白具有植物ANS特有的2OG-FeⅡ＿Oxy氧化酶结构域,与蓝果忍冬、榴莲、雷公藤、三七等植物ANS蛋白序列的同源相似性较高,荧光定量PCR和花色苷含量相关性分析结果表明,rLjANS1基因表达量与花色苷含量呈明显正相关,说明rLjANS1在红白忍冬花色苷代谢及色泽形成过程中具有重要作用。研究结果为深入研究红白忍冬色泽形成机制奠定了基础。     

刺葡萄DFR基因克隆及生物信息学分析

根据葡萄DFR基因CDS序列设计刺葡萄开放阅读框(ORF)特异引物,利用RT-PCR技术克隆获得其DFR基因序列,并通过生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,刺葡萄DFR基因ORF序列全长1 014bp,编码337个氨基酸,命名为Vitis davidii dihydroflavonol 4-reductase gene(VdDFR),GenBank登录号为KF915803。刺葡萄DFR蛋白预测分子量为37 593.2Da,理论等电点pI为5.81,是一个跨膜亲水蛋白,无典型信号肽,不属于分泌蛋白,并且亚细胞定位主要位于细胞质中(70%);二级结构以无规则卷曲为主(52.82%),是一种mixed类蛋白;该蛋白有潜在的7个糖基化位点和16个磷酸化位点,具有NAD(P)结合位点,有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域,属于NADB_Rossmann超家族成员。核苷酸序列分析表明,刺葡萄DFR基因与美丽葡萄、山葡萄和酿酒葡萄的同源性为99%,与圆叶葡萄同源性为98%,与显齿蛇葡萄同源性为94%,进化上比较保守,利用DFR基因编码区碱基序列所建立的系统关系树与真实的植物进化基本一致。     

黄颡鱼胰岛素样生长因子结合蛋白1基因的克隆及表达分析

为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基因核苷酸序列与鲇形目斑点叉尾鮰的相似度(89%)较高,与鲢、鲤、鲫、草鱼和团头鲂等的差异较大;肝脏是黄颡鱼IGFBP1基因m RNA表达最丰富的组织,IGFBP1基因在雄性个体心脏、肾脏、肌肉和肠组织中的表达量显著高于雌性的(P0.05);IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉组织中都有表达,且在雄性个体中的表达量高于在雌性个体中的表达量。