苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白vip3A-LS1基因的克隆与表达

从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LS1菌株,分子检测该菌株中存在营养期杀虫蛋白基因,进行了该基因的克隆和表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段,序列分析证实为新vip3A基因,命名为vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968,Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白有8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体,SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达;生物测定表明,胞内可溶性蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2μg/g。     

苏云金芽胞杆菌新型vip3Aa基因的克隆、表达与活性分析

为了发掘新型vip3基因,本研究采用PCR和高分辨熔解曲线的方法对72株菌株中vip3基因进行了鉴定和分析,结果表明,有18株菌呈阳性,分别含有vip3Aa、vip3Af和vip3Ba共3类vip3基因。根据已知vip3基因的全长序列设计引物,以菌株T03B001(B.thuringiensis subsp.sumiyoshiensis)的总DNA为模板扩增出长为2.37kb的全长基因,插入表达载体pEB,转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)菌株,在低温条件下经IPTG诱导后,表达88kD的蛋白,该蛋白由789个氨基酸组成,与已知的Vip3Aa氨基酸一致性为96%,已被国际Bt命名委员会正式命名为Vip3Aa39,GenBank登录号为HMI17631。Vip3Aa39蛋白与本实验室此前获得的Vip3Aa11蛋白进行比较,发现两者存在39个氨基酸的差异。两种蛋白的表达产物采用饲喂法分别对小地老虎(Agrotis ipsilon)、小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua...     

苏云金芽孢杆菌Ly30株cry1Ac基因的克隆及表达*

Bt菌Ly30株是中国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定。它含有cry1Ac基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pET-21b相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌(Eschrichia coli),获得含有cry1Ac基因重组质粒pEKLy1Ac。该基因的亚克隆和序列测定结果表明,其编码区为3534bp。编码蛋白分子量为133.5kD,含1177个氨基酸,等电点为4．8,与CrylAc3同源性最高,存在4个氨基酸的差异,与Cry1Ac10之间则有6个氨基酸的不同。该基因序列已在GenBank中登记注册为AF482767,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac14该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133．5kD蛋白带。室内生物测定结果表明,诱导表达的Cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性,其LC5o值分别为19.236和3276μg／g饲料。     

苏云金芽胞杆菌WB5中营养期杀虫蛋白3Aa基因(vip3Aa)的克隆、表达与纯化

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,Vip)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为Vip1、Vip2和Vip3三种,以Vip3的研究最为深入。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性,具有重要研究意义。本研究以Bt WB5菌株总DNA为模板,采用PCR方法扩增vip3Aa(Gen Bank登录号:AAM22456)全长,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行酶切验证和序列测定。将vip3Aa基因片段与经同样酶切的表达载体p Czn1连接,构建重组表达载体p Czn1-vip3Aa,转入大肠杆菌Arctic ExpressTM(DE3),异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在沉淀和上清中均有约88 k D VIP3Aa蛋白质表达产物;采用Ni亲和树脂对上清中的VIP3Aa融合表达蛋白进行了纯化,获得了纯化蛋白。本研究成功亚克隆了vip3Aa基因,并表达纯化了VIP3Aa蛋白,为后续研究VIP3Aa蛋白在昆虫中肠的作用受体提供了基础资料。     

Expression of the Truncated vip3A Gene at the 3'-terminus from Bacillus thuringiensis in Escherichia coli

将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)缺失C端154个氨基酸编码区的vip3A基因(vip3T)插入原核表达载体pQE30，构建了重组表达载体pQEvip3T，并转化大肠杆菌(Escherichia coli ) M15进行IPTG诱导表达，比较了完整的Vip3A蛋白和C端缺失的蛋白Vip3T的可溶性和杀虫活性。与Vip3A不同，融合蛋白Vip3T以不可溶的包含体形式存在，诱导表达的菌液中没有检测到可溶性Vip3T蛋白。生物测定结果表明，M15(pOTP)诱导表达的Vip3A蛋白对初孵斜纹夜蛾(Spodoptera litua)和甜菜夜蛾(S. exigua)幼虫具有较高的杀虫活性，其提纯的包含体无毒，但包含体的碱性裂解液却又恢复了对夜蛾科害虫的活性；M15(pQEvip3T)菌液、包含体及其碱性裂解液对这两种昆虫幼虫则完全无毒，说明在大肠杆菌中，Vip3A蛋白C端氨基酸可能对Vip3A蛋白的可溶性和杀虫活性具有重要的影响。     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

Ghppo1基因在棉花防御中的表达及功能分析

诱导型抗性在植物防御植食性昆虫过程中起到重要作用,植物可通过基因和信号通路调控植物与害虫之间的互作。本研究以转Bt+Cp TI(苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)+豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor))基因的抗虫棉品种中棉所41为材料,使用定量PCR分别测定棉铃虫(Helicoverpa armigera)危害、喷施茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me-JA)和水杨酸甲酯(methyl salicylate,Me-SA)等处理0、6、12、18和24h后,棉花Ghppo1(Gossypium hirsutum polyphenol oxidases 1)基因、茉莉酸途径关键基因Gh AOS(Gossypium hirsutum allene oxide synthase)、Gh COI1(Gossypium hirsutum coronatine insensitive1)表达量变化。交互取食试验测定1龄棉铃虫诱导及茉莉酸甲酯诱导18 h后棉花饲喂3龄棉铃虫与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)虫重变化。以了解棉花Ghppo1基因在棉花诱导型抗性及棉花-棉铃虫互作关系中的作用。结果表明,1龄棉铃虫取食以及喷施Me-JA能够诱导棉花Ghppo1基因表达量显著升高,而3龄棉铃虫取食及喷施Me-SA不能诱导棉花Ghppo1基因表达量升高。此外棉花多酚氧化酶(polyphenol oxidases,PPOs)同样受1龄棉铃虫取食和茉莉酸甲酯诱导,而不受3龄棉铃虫和水杨酸甲酯诱导。1龄棉铃虫取食能够诱导茉莉酸途径关键基因Gh AOS和Gh COI1表达量显著上升。交互取食试验结果表明1龄棉铃虫诱导后的棉花植株能够抑制3龄棉铃虫及甜菜夜蛾的生长发育。棉花Ghppo1基因受茉莉酸途径而不受水杨酸途径调控,棉花Ghppo1基因参与棉花对棉铃虫的诱导型抗性反应。本实验结果表明,1龄棉铃虫可明显提高棉花对棉铃虫及甜菜夜蛾的抗性,棉花Ghppo1基因在棉花对棉铃虫与甜菜夜蛾抗性中发挥重要作用。     

HPT-ELISA方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用

本文改进了HPT-ELISA检测法,利用一种简便并且高效的微生物表达体系,将hpt基因的全编码序列克隆到原核表达质粒pGEX-KG上,在E.Coli菌株BL21(DE3)-pLys中进行诱导表达,获得了融合蛋白GST-HPT,经Thrombin凝血酶酶切过夜,再经过柱纯化后获得不含GST且具有生物活性的HPT纯蛋白,所得蛋白纯度>90%。MALDI-TOF-MS分析表明,HPT蛋白分子量为39.4KD。用HPT纯蛋白免疫家兔,制备了高效价的多克隆抗体,进而构建了双抗夹心酶联免疫检测方法,其灵敏度为0.31ng/ml。应用该HPT-ELISA方法,测定了不同生育期转Bt基因水稻植株中HPT蛋白的表达水平以及成熟期稻米中的HPT蛋白含量。结果表明,不同生育期转Bt基因水稻植株中HPT蛋白的表达量约为15.67~60.12ng/g.FW,转Bt基因稻米中HPT蛋白的含量为5.28ng HPT/g.FW,而在非转基因亲本的植株和稻米中均未检测到HPT蛋白。     

一株对马铃薯瓢虫幼虫有特异活性的苏云金芽孢杆菌新菌株的研究

苏云金芽孢杆菌WZ-9是本室从河北省土壤中分离的对马铃薯瓢虫的幼虫有特异杀虫活性的新菌株，本文对该菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等方面进行了研究。结果表明该菌株可产生菱形伴孢晶体，SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa，生长周期是24h，随菌株的生长培养基pH值发生变化；生物活性测定表明该菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72h校正死亡率达100%，LC50为2.95×107细胞/mL；基因型鉴定表明含有cry7基因，获得了一条总长为3781bp基因序列，其中包含了一个3414 bp的开放读码框，其编码的蛋白由1138个氨基酸残基组成，与Cry7Ab2具有99.65%的序列同源性，存在4个氨基酸差异，亲缘关系最近，该蛋白被Bt 杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3( 登录号为BI 1015188) 。     

基因工程菌诱导表达苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的条件优化

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,Vip)是在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养生长至对数中期到稳定期期间产生的一类蛋白。为获得苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的高效表达条件,本研究利用正交试验综合考察了大肠杆菌(Escherichia coli)重组基因工程菌BL21-p Czn1-Vip诱导过程中诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对Vip3Aa蛋白表达量的影响。结果表明,该工程菌目的蛋白的最优诱导表达条件:诱导温度21℃、诱导时间8 h、诱导剂(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG))浓度为200μg/m L;直观分析表明,影响目的蛋白表达量的最主要因素为诱导温度,其次为诱导时间,诱导剂浓度影响最小;方差分析结果表明,诱导温度的P值0.01、诱导时间的P值0.05、诱导剂浓度的P值0.05,与直观分析结果相一致;利用优化后诱导表达条件进行培养,测得目的蛋白最高表达量可占总蛋白的27.6%,相当于常规诱导方法的2.3倍。本研究为大量制备高纯度Vip3Aa蛋白及其深入的理论研究和实践应用提供了基础资料。     

苏云金芽孢杆菌vip2A(c)基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)Bac-to-Bac表达系统在粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)TnHi5细胞中表达了GFP与Vip2A(c)酶活成分区域的融合蛋白(GV2融合蛋白),研究了该蛋白对昆虫细胞和病毒产生的影响。Bac-gfpDNA转染48h后部分TnHi5细胞已经检测到荧光,48￣120h出现荧光的细胞数目增加,最后70%左右的细胞都有较强的荧光。而Bac-gv2DNA转染后2￣5d仅有极少TnHi5细胞出现荧光且多呈零散分布,推测这可能是由于杆状病毒极晚期表达的GV2融合蛋白中的Vip2A对细胞骨架成分肌动蛋白进行ADP-核糖基化,从而影响了芽生型病毒粒子(BV)的正常产生或限制了BV在其它细胞间的传播。     

苏云金芽孢杆菌vip2A(c)基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)Bac-to-Bac表达系统在粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni ) TnHi5细胞中表达了GFP与Vip2A(c) 酶活成分区域的融合蛋白(GV2融合蛋白)，研究了该蛋白对昆虫细胞和病毒产生的影响。Bac-gfp DNA转染48 h后部分TnHi5细胞已经检测到荧光，48~120 h出现荧光的细胞数目增加，最后70％左右的细胞都有较强的荧光。而Bac-gv2 DNA转染后2~5 d仅有极少TnHi5细胞出现荧光且多呈零散分布，推测这可能是由于杆状病毒极晚期表达的GV2融合蛋白中的Vip2A对细胞骨架成分肌动蛋白进行ADP-核糖基化，从而影响了芽生型病毒粒子(BV)的正常产生或限制了BV在其它细胞间的传播。     

A quantitative immunopolymerase chain reaction method for detection of vegetative insecticidal protein in genetically modified crops

Vegetative insecticidal protein (Vip) is being employed for transgenic expression in selected crops such as cotton, brinjal, and corn. For regulatory compliance, there is a need for a sensitive and reliable detection method, which can distinguish between approved and nonapproved genetically modified (GM) events and quantify GM contents as well. A quantitative immunopolymerase chain reaction (IPCR) method has been developed for the detection and quantification of Vip protein in GM crops. The developed assay displayed a detection limit of 1 ng/mL (1 ppb) and linear quantification range between 10 and 1000 ng/mL of Vip-S protein. The sensitivity of the assay was found to be 10 times higher than an analogous enzyme-linked immunosorbent assay for Vip-S protein. The results suggest that IPCR has the potential to become a standard method to quantify GM proteins.     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3研究进展

营养期杀虫蛋白（vegetative insectcidal protein,VIP）是由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为VIP1、VIP2和VIP3三种,以VIP3的研究最为深入。VIP3A对鳞翅目害虫具广谱杀虫活性,可作用于敏感昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊致离子通道的形成,杀虫活性达纳克级水平。利用Bt ICPs不同启动子与vip3基因重组可提高VIP3蛋白的表达量和稳定性。转vip3基因植物也已有构建成功的报道。本文从VIP3的类型和杀虫活性、作用机理、vip3基因的定位和分离、vip3基因重组和转vip3基因植物等方面详细介绍了VIP3近十年来的研究进展。     

赤羽病病毒囊膜糖蛋白G1基因的截短表达、纯化及间接ELISA诊断方法的建立

为获得赤羽病病毒（Akabane Virus, AKAV）囊膜糖蛋白重组抗原作诊断应用研究,通过软件分析AKAV OBE-1株的囊膜糖蛋白G1的氨基酸序列,筛选出抗原性较好的基因片段G1-2作为目的片段,经RT-PCR扩增后,插入pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段定向亚克隆于pET-28a (+)表达载体中,转化至BL21 (DE3)感受态细胞中进行诱导表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析,诱导表达产物以包涵体的形式存在,大小约为40ku,且具有免疫学活性。亲和纯化后的融合蛋白浓度为2mg/ml,纯度为92.6%。以该融合蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为20g/ml,血清最佳稀释度为1:200。交叉试验表明该方法对牛常见的6种疾病阳性血清无交叉反应。应用该方法对病毒微量中和试验检测过的云南（77份）和内蒙（70份）牛血清样品进行了检测。以中和试验为参照,通过统计学处理,得出两地临界值分别为0.493和0.488,本方法的特异性为73%和86.9%,二者的符和率分别为80%和85.9%。     

ISO-DALT和IPG-DALT系统分离棉铃虫Cry1Ac受体比较

利用双向电泳分离棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白,对于进一步明确棉铃虫受体的种类、发现新受体、寻找可能与抗性有关的受体非常重要。根据第一向等电聚焦的方式不同,可将双向电泳分为两种系统：ISO-DALT(isoelectric focus-dalton weight)和IPG-DALT（immobilized pH gradient-dalton weight）。确定最适合的双向电泳方法,可以为进一步研究受体蛋白奠定基础。本研究比较了ISO-DALT和IPG-DALT两种双向电泳系统结合western blotting技术分离棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白的效果。结果表明,这两种系统都可以用于棉铃虫Cry1Ac受体的分离,ISO-DALT对受体分离效果比IPG-DALT更好,ISO-DALT比较经济但对后续的质谱工作不利,IPG-DALT较昂贵但有利于进行后续试验。     

过量表达CHIP蛋白抑制小鼠前成骨细胞分化和矿化

摘要 以MC3T3-E1细胞系为实验材料，体外转染pEFNeu-HA-CHIP质粒，Western blot检测CHIP蛋白表达，建成了稳定过表达CHIP 蛋白的MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系。然后用含10mM/ml甘油磷酸钠和50ug/ml抗坏血酸的α-MEM条件培养基诱导MC3T3-E1和MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系向成骨细胞定向分化，结果表明诱导期MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系中的ALP活性比MC3T3-E1细胞中的ALP活性低，ALP染色实验同时证实了这个结果；诱导培养18天以后，Von Kossa染色和茜素红染色结果表明MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙少。以上结果表明过表达CHIP蛋白抑制MC3T3-E1细胞的分化和矿化。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物，以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因，插入大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成，推导的分子量为81.2kDa。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白，是一种新的Cry1Ia蛋白，该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明：Cry1Ia8对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、小菜蛾（Plutella xylostella）有很强的杀虫活性，LC50分别为0.268 µg/g、2.227 µg/ml，其杀虫效果与Cry1Ab、Cry1Ac相当。对大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）也有较好的活性，但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲（Pyrrhalta aenescens）没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源，为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了极为重要的依据。