潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备

从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体.     

潮霉素磷酸转移酶的原核表达纯化及其抗体制备

本研究从转基因玉米基因组上成功克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamHⅠ和Hind III 双酶切作用,将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接成功构建pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3) 菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了潮霉素磷酸转移酶（HPT）,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔子制备了特异性强的多克隆抗体。     

双Bt基因提高青花菜对菜粉蝶和小菜蛾抗性

以青花菜（Brassica oleracea L.ssp.italica）下胚轴为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）晶体毒蛋白基因Cry1Ac和Cry1C分别导入青花菜栽培品种绿彗星中,各获得35株卡那霉素抗性植株。分别以Cry1Ac和Cry1C特异引物对转基因植株进行PCR扩增,结果得到27株Cry1Ac阳性植株和13株Cry1C阳性植株。以目的基因Cry1Ac和Cry1C为探针,进行Southernblot分析,证明多数植株目的基因已经整合到青花菜基因组中。对含有单拷贝目的基因植株自交纯合后通过有性杂交获得带有Cry1Ac和Cry1C双价的转基因青花菜。利用RT-PCR检测Bt基因在转基因植株中的表达情况,发现不同株系间在RNA水平上存在显著的表达差异,部分株系中双价Bt同时得到表达。ELISA检测转基因植株Bt毒蛋白含量为0.12～0.82μg/gFW。结合室内和田间饲虫试验,证明抗虫效果与Bt毒蛋白表达水平正相关。通过多世代选择,获得高抗菜粉蝶（Pieris rapae L.）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）的纯合转基因青花菜材料。双价抗虫基因共同作用,提高了青花菜的抗虫性。     

过表达SlMPK3基因提高番茄低温耐受能力

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK/MPK)级联是植物响应外界环境变化的重要信号传导途径.为了验证番茄促分裂原活化蛋白激酶3(Solanum lycopersicum mitogenactivated protein kinases 3,S1MPK3)在低温胁迫中的功能,本研究将醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)SlMPK3基因在栽培番茄(S.lycopersicum)M82中过表达,获得了过表达SlMPK3的转基因番茄后代.结果表明,低温胁迫下转基因番茄幼苗SlMPK3基因被迅速诱导表达.低温处理8h处,SlMPK3的表达量达到最大值,转基因植株(OE4,OE6和OE7)中SlMPK3的表达量显著高于野生型(P＜0.05).苗期耐冷性鉴定结果表明,转基因植株耐冷指数(OE4(0.81),OE6 (0.78),OE7(0.77))显著高于对照((0.37),P＜0.05).低温胁迫下表型观察发现,4℃低温胁迫24 h,野生型番茄叶片边缘失水萎蔫,叶面出现明显黄色枯斑;转基因番茄植株叶片表现正常.低温胁迫120 h后,野生型植株的相对电解质渗透率为74.66％,而转基因植株的电解质渗透率平均为59.79％,比对照低14.87％;转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量为6.76 μmol/g FW,比对照(9.77 μmol/g FW)低30.81％;野生型植株叶片中的H2O2含量显著高于转基因植株(P＜0.05),比转基因植株高22.02％.低温胁迫处理引起了转基因植株和野生型植株的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs)活性显著增加(P＜0.05),低温处理120 h后,转基因植株中超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性分别比对照高29.40％、24.24％和22.83％.转基因和野生型植株中可溶性蛋白(soluble protein)和可溶性糖(soluble sugar)含量均随低温处理时间的推移逐步增加,4℃处理120 h后转基因植株可溶性蛋白含量为40.02 mg/g FW (OE-4),42.21 mg/g FW (OE-6)和40.33 mg/g FW (OE-7),显著高于对照(36.86 mg/g FW)(P＜0.05);转基因植株可溶性糖含量平均为51.87 mmol/g FW,比对照高21.82％.本研究证明,SlMPK3过表达提高了番茄植株的低温耐受能力,为进一步研究番茄SlMPK3基因的功能提供依据,同时为耐低温番茄育种提供了新种质.     

转Bt抗虫棉各器官毒蛋白的含量及表达

以转Bt毒蛋白基因抗虫棉（Gossypium hirsutum L.)中棉所30为实验材料，用ELISA（酶联免疫吸附测定法）测定植株Bt毒蛋白含量，研究在大田栽培条件下中棉所30不同器官中Bt毒蛋白含量及时空变化。结果表明：转Bt基因棉不同器官中的Bt毒蛋白含量存在着明显差异，叶片中的Bt毒蛋白含量远远高于蕾，花，铃，而蕾，花，铃中的含量差异不大。主茎叶片中（07－19标记）Bt毒蛋白含量在叶片展开后0－28d随叶增大而升高，28－48d含量比较稳定。果树叶中Bt毒蛋白含量的变化规律与主茎叶基本相同，种子和铃壳在花后20d时Bt毒蛋白含量最低，前期和后期差别较小。在不同生育阶段，相同发育期的叶，蕾，花，铃毒蛋白的表达并未出现明显的前期高，后期低或者峰谷现象。     

作物转Bt抗虫基因育种研究进展

本文概述了Bt抗虫基因的特性及其人工合成和转导技术 ,并根据转Bt基因作物种质的特点和遗传缺陷 ,总结了进行转Bt基因作物育种改良的策略 ,介绍了国内外转Bt基因植株鉴定、筛选技术和育出的优良品系及商业化生产状况 ,讨论了Bt抗虫基因在育种应用中存在的问题及其解决途径     

转基因水稻B2A68中抗虫蛋白Cry2Aa的表达特征和抗性分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因的高效表达和稳定遗传对抗虫转基因水稻(Oryza sativa)的培育和商业化生产至关重要。转基因水稻B2A68是通过农杆菌介导法把双丙氨酰磷抗性基因(biplaphos resistance gene,Bar)和Bt杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal proteins gene)Cry2Aa同时转入到恢复系D68中,培育出的抗除草剂、抗螟虫的两系早稻恢复系。本研究运用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测法研究了B2A68纯杂合基因型、不同组织及不同发育时期叶片中Cry2Aa蛋白的时空表达特征,并结合室内生测实验,揭示抗虫蛋白的表达水平、时期、部位与抗虫性的相关性。研究表明,转基因抗虫水稻B2A68纯合植株叶片中Cry2Aa蛋白表达量极显著高于杂合植株。乳熟期各器官中Cry2Aa蛋白含量为:叶片颖壳和脱壳籽粒茎秆和叶鞘(P0.05);腊熟期各器官中Cry2Aa蛋白含量为:叶片脱壳籽粒茎秆和颖壳(P0.05),但脱壳籽粒和叶鞘之间、叶鞘和茎秆之间、茎秆和颖壳之间的Cry2Aa蛋白含量差异不显著。从秧苗期到腊熟期的叶片中Cry2Aa蛋白含量表现为先升后降再升高的波动,且T_3、T_4两代波动趋势一致。二化螟幼虫(Chilo suppressalis)死亡率与乳熟期各器官中的Cry2Aa蛋白含量高度相关(r=0.837),稻纵卷叶螟幼虫(Cnaphalocrocis medinali)死亡率与各发育时期叶片中的Cry2Aa蛋白含量高度相关(r=0.988)。Cry2Aa蛋白含量较低的杂合植株叶片对稻纵卷叶螟幼虫的全部致死时间稍长,但不超过5 d。本研究结果对田间害虫的防治以及转基因水稻的育种都具有参考价值。     

转KN1毛果杨细胞分裂素、赤霉素含量及其相关形态结构

为了研究KN1基因超量表达对木本植物生长发育的影响,本研究测定了转KN1基因毛果杨细胞分裂素类激素及赤霉素的含量,并进行表型及解剖结构观察。结果表明,转基因毛果杨植株细胞分裂素类激素ZR、dhZR和iPA的含量分别为14.14ng/g、18.29ng/g和12.43ng/g,明显高于对照的9.44ng/g、12.47ng/g和7.60ng/g,而赤霉素GAs含量为9.61ng/g,低于对照的12.14ng/g,从而引起其植株矮化、分枝增加、叶片增厚、叶色变深、表皮细胞增大、栅栏和海绵组织发达等现象。本研究将为探索KN1基因对木本植物生长发育的影响提供依据。     

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白vip3A-LS1基因的克隆与表达

从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的Bt LS1菌株。分子检测菌株中存在营养期杀虫蛋白基因，进行了该基因的克隆表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段；克隆序列分析证实为新Vip3A基因，命名为Vip3A-LS1，GenBank登录号DQ016968，Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体，SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达；生物测定表明，胞内可溶性蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2µg/g。     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

Bt水稻杀虫蛋白时空变化及秸秆还田后在土壤中的持留规律

以Bt抗虫水稻华池B6、TT51及其非转基因水稻亲本嘉早935、明恢63,以及与它们亲缘较远但农艺性状相近的水稻品种中九B、R9311为试验材料,研究了田间种植条件下Bt抗虫水稻杀虫蛋白的时空变化及其在根际土中的持留规律,同时,还研究了秸秆还田后Bt蛋白在土壤中的持留规律。结果表明：1）Bt抗虫水稻华池B6植株各个部位...     

Changes in Germination and Physiochemical Properties of Transgenic cry1Ab/cry1Ac Gene Rice During Long‐Term Storage

The changes in germination, free fatty acid (FFA), and viscosity of the transgenic Bacillus thuringiensis (Bt) rice expressing the cry1Ab/cry1Ac gene and its associated Bt protein were observed at three‐month intervals during 24 months of storage at ambient temperature and relative humidity. After nine months of storage, FFA of transgenic Bt rice was significantly lower than that of nontransgenic rice, while germination was significantly higher. Rates of change of FFA and germination in transgenic rice were lower than in nontransgenic rice. The content of Bt protein in the husk and in the brown rice both decreased 80% during 24 months of storage. Our observations suggest that transgenic Bt rice used in this study had long‐term storability.     

转Bt基因棉种植对根际土壤生物学特性和养分含量的影响

通过盆栽试验,比较了转Bt基因棉Bt新彩1和Bt基因的受体棉新彩1根际土壤可培养微生物种群数量、酶活性及养分含量的变化。结果表明,Bt新彩1根际土壤可检测到Bt蛋白,且花期达到峰值56.14 ng/g;与对照新彩1相比,Bt#61472;新彩1根际土壤更有利于细菌和真菌的生长和繁殖,放线菌数量没有显著变化。Bt新彩1的根际土壤碱性磷酸酶活性受到抑制,在生长旺盛期脱氢酶活性受到激活,而根际土壤蛋白酶、脲酶和蔗糖酶活性无显著变化;苗期、花期Bt新彩1根际土壤有机质、全氮、速效氮和钾含量没有显著变化,且苗期速效磷含量也没有显著改变,花期其含量显著降低。     

水稻穗期活体植株对潮霉素的敏感性分析及突变体选育

携带潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的转基因作物细胞和组织对抗生素潮霉素具有一定耐性,是作物尤其是单子叶作物遗传转化中常用的选择基因。本研究旨在建立一种活体植株潮霉素抗性快速鉴别技术,用于转基因育种和相关研究。在始穗期前后,用不同浓度潮霉素B溶液(25～100mg/L)喷洒常规及转基因水稻植株,考察叶片和谷粒的中毒症状。发现常规水稻在高于50mg/L的潮霉素溶液处理后,叶片出现褐色斑点,稻穗部分谷粒颖壳呈黄褐色的中毒症状,叶片斑点和黄褐色谷粒的数量均随剂量增大而增加。经100mg/L潮霉素处理后,籼稻品种嘉优99和C10剑叶每平方厘米平均斑点数目为21.1和19.2个,穗上黄褐色谷粒比例分别达27.6%和23.5%;粳稻品种嘉优5号和R5叶片中毒斑点数为11.8和10.7个,黄褐色谷粒比例分别为11.2%和11.9%,表明2份籼稻材料较2份粳稻材料对潮霉素更为敏感。在上述浓度范围内,携带HPT的转Bt基因水稻克螟稻1号均未出现中毒症状。对γ射线诱变处理克暝稻的M2群体(共12万株)穗期喷施100mg/L的潮霉素B溶液,从中筛选到42株潮霉素敏感型突变体,组织化学法分析表明这些植株具有β-葡萄糖苷酸酶GUS活性。对能够取到较嫩叶片的14个单株采用离体叶片法进行抗虫性鉴定,证明这些植株对二化螟仍然表现高抗。上述结果表明,在始穗期喷施100mg/L潮霉素溶液,潮霉素敏感植株可出现明显、直观的中毒症状,可以在活体植株水平上有效鉴别植株是否携带HPT,可用于育种中转基因植株的筛选或转基因安全评估中植株的鉴别。     

Cry1Ac蛋白降解菌株FJSB3的分离鉴定及降解特性

从转Cry1Ac基因水稻种植田土壤中,分离纯化得到1株能高效降解Cry1Ac蛋白的细菌FJSB3。通过表型特征、16S rDNA扩增和电镜观察,初步鉴定FJSB3为寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。FJSB3发酵液能降解粗Bt蛋白。通过单因素试验确定FJSB3降解水稻秸秆中Cry1Ac蛋白的最适条...     

Indicated detection of two unapproved transgenic rice lines contaminating vermicelli products

We analyzed the DNA fragments extracted from four rice vermicelli products. The Bacillus thuringiensis (Bt) rice line, which has a construct similar to the GM Shanyou 63 line, was detected in some vermicelli products by identification of the junction region sequence between rice Act1 promoter and the Cry1Ac gene, and that between Cry1Ac and nos. In addition, we also detected a different Bt rice line by means of the junction region sequence between the maize ubiquitin promoter and cry1Ab gene and that between the cauliflower mosaic virus 35S promoter and the hygromycin phosphotransferase in some vermicelli products. Accordingly, we for the first time have detected the two transgenic Bt rice lines contaminating rice vermicelli samples. Furthermore, we developed a duplex real-time polymerase chain reaction (PCR) method for the simultaneous detection of both Bt rice lines.     

转Bt基因“克螟稻”秸秆还田对稻田厌氧微生物种群和酶活性的影响

采用改良亨盖特技术,通过最大或然数法(mostprobablenumber,MPN法)及固体滚管法,系统研究了转Bt基因克螟稻秸秆对淹水条件下稻田土壤厌氧微生物种群的影响;同时采用比色法,研究其对土壤酶活性的影响。结果表明,克螟稻秸秆对水田土壤反硝化细菌和产甲烷细菌种群有显著的抑制作用(p0.05);对厌氧发酵细菌种群有显著的刺激作用(P0.05);而对厌氧固氮细菌种群有刺激作用但差异未达到显著水平(p0.05)。克螟稻秸秆还田在短期内可显著提高土壤纤维素酶、磷酸酶活性(p0.05),但对脱氢酶活性有明显抑制作用(p0.05)。     

辐照处理对Bt水稻苗期生理生化特性的影响

分别以50、100、150、250和350Gy的60Co γ射线处理Bt水稻成熟干种子,将其培养成实生苗,进行苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等的活性以及叶绿素含量、根系活力和种子萌发时淀粉酶活性的检测,并观察水稻苗期的生长状况,以研究不同辐射强度对Bt水稻...     

Soil persistence of <Emphasis Type="Italic">Bacillus thuringiensis</Emphasis> (Bt) toxin from transgenic Bt cotton tissues and its effect on soil enzyme activities

A silty loam soil was incubated with the leaves and stems of two transgenic Bacillus thuringiensis (Bt) cotton varieties and nontransgenic Bt cotton to study the soil persistence of the Bt toxin from the decomposing transgenic Bt cotton tissues and its effect on soil enzyme activities. The results showed that after Bt cotton tissue amendment, Bt toxin was introduced into soil upon decomposition; about 50% of the introduced Bt toxin persisted in soil for at least 56 days. No Bt toxin was detected in the nontransgenic Bt cotton-amended soil; the amount of Bt toxin was the highest in the soil treated with the residue with the higher Bt toxin content. Activities of soil urease, acid phosphomonoesterase, invertase, and cellulase were stimulated by the addition of Bt cotton tissues, whereas activity of soil arylsulfatase was inhibited. Probably cotton tissue stimulated microbial activity in soil, and as a consequence, enzyme activities of soil were generally increased. This effect can mask any negative effect of the Bt toxin on microbial activity and thus on enzyme activities.     

Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测技术研究

通过苏云金芽孢杆菌(Bt)HD-73培养,提取Bt晶体蛋白Cry1Ac,经酶解后获得高抗虫活性蛋白。免疫新西兰白兔得到高纯度的Bt晶体蛋白1Ac抗体,用125I标记抗原,研究和建立了Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测技术,该试剂盒用磁性微粒作分离剂,不需离心即可分离,简化了测定步骤,检测结果达到国外同类产品(酶联免疫试剂盒)的水平。