ETT2转录因子EivF调控禽致病性大肠杆菌运动性和环境胁迫耐受性

为探究禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)中大肠杆菌Ⅲ型分泌系统(Escherichi-a coli TypeⅢsecretion system2,ETT2)转录因子EivF的功能,通过透射电镜观察检测野生株(AE81)、缺失株(AE81△eivF)和回复株(...     

禽致病性大肠杆菌ETT2转录因子eivF缺失株的生物学特性及转录组学分析

【目的】构建禽致病性大肠杆菌(APEC)Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录因子eivF缺失株,并对其进行生物学特性及转录组学分析,探究转录因子eivF基因在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建APEC ETT2转录因子eivF基因缺失的APEC AE81△eivF株及其回复株AE81 C-eivF,通过运动性、生物被膜形成等试验分析eivF对APEC生物学功能的影响;并利用转录组学方法分析eivF在转录调控网络中对细菌鞭毛和生物被膜等相关因子的转录调控作用。【结果】成功构建了APEC eivF基因缺失株AE81△eivF和回复株AE81 C-eivF;生物学结果表明,与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF运动能力降低,生物被膜形成褶皱堆砌且厚度增大,空间结构呈立体、多层次状,并形成类似于三维塔状结构的突起,回复株AE81 C-eivF运动能力和生物被膜形成能力基本恢复;与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF有576个基因差异表达,且鞭毛和生物被膜等相关基因在转录水平上均发生显著变化。【结论】ETT2的转录因子eivF参与调控APEC的生物表型变化,其可能通过调控鞭毛、生物被膜相关基因而调控APEC致病过程。     

禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因缺失对雏鸡脾脏microRNAs功能的影响

从microRNA(miRNA)水平探究禽致病性大肠杆菌(APEC)phoP/Q基因缺失对雏鸡脾脏功能表达的影响,为APEC的防制提供参考资料。用禽致病性大肠杆菌和其phoP/Q基因的缺失株分别攻毒14日龄雏鸡,采集其脾脏组织为材料进行高通量测序获得miRNA表达谱,选择差异倍数大于8的miRNA进行Real-time PCR,对差异表达的miRNA进行靶基因预测以及GO、KEGG富集分析。测序结果获得10个差异表达的miRNA,其中1个miRNA表达量下调,9个miRNA表达量上调,Real-time PCR结果表明,miRNA变化趋势与测序结果一致,GO分析结果表明,差异表达基因主要富集在能量代谢、免疫系统、细胞生长与凋亡、糖合成与代谢等生物学过程。KEGG分析结果显示预测靶基因参与MAPK信号通路、糖代谢通路、Wnt信号通路等重要通路。本试验分析禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因缺失后感染雏鸡脾脏miRNA的表达差异,从miRNA水平探讨了phoP/Q基因缺失对APEC致病性的影响,为APEC的防治提供参考资料。     

hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

【目的】探究毒素-抗毒素（TA）系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌（APEC）生物学特性和致病性的影响，为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA，测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力，并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因（hdeA、hdeB）、黏附相关基因（fimF、fimH）、毒力相关基因（hcp、ompR、ompC）的转录水平，探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比，hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低，对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱，鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小，对鸡胚成纤维细胞（DF-1）的黏附能力极显著减弱（P＜0.01），回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示，与野生株AE81相比，AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低（P＜0.05），hcp基因转录水平差异不显著，但fimH转录水平显著升高（P＜0.05）。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力，参与APEC的致病过程。     

组氨酸激酶基因envZ调控禽致病性大肠埃希菌生物被膜的机制研究

目的 研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物被膜形成能力的影响,了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制,为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌耐药性的途径提供参考。方法 采用Red同源重组的方法构建envZ基因缺失株,比较野生株和envZ基因缺失株生长特性、生物被膜形成能力的差异。利用转录组学方法分析envZ在转录调控网络中对其生物被膜形成相关基因的调控机制。结果 成功构建envZ基因缺失株AE17ΔenvZ;envZ基因缺失对APEC的生长速度无明显影响,但使APEC生物被膜的成膜能力减弱。与野生株AE17相比,envZ基因缺失株有711个基因发生差异表达,与生物被膜形成相关的基因显著下调。结论 envZ基因除了响应环境渗透压,还参与调控APEC生物被膜的形成。     

禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失对雏鸡气管黏膜 细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的影响

为探究clpV基因在禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli, APEC）感染雏鸡气管黏膜过程中发挥的作用及机制。将APEC野生株（DE17）及其基因缺失株（DE17ΔclpV）感染7日龄雏鸡气管,12、24 h后收集雏鸡气管黏膜细胞进行转录组学测序,筛选野生株和缺失株的差异表达基因,进行GO和KEGG富集分析。结果显示,在感染12 h后,共筛选到108个差异表达基因（36个上调,72个下调）;在感染24 h后,共筛选到59个差异表达基因（34个上调,25个下调）。GO分析表明,差异表达基因主要富集在细胞内信号转导、RNA聚合酶Ⅱ的转录正调控等生物学过程;蛋白质结合、ATP合成、DNA结合等分子功能类;生物膜及膜的组成成分、细胞质等细胞组分功能;KEGG分析表明,差异表达基因主要富集在紧密连接通路、内质网中的蛋白质加工通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、内吞通路、Wnt信号通路等。结论为clpV基因缺失后,会使部分差异表达基因的表达量下调,对细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路产生影响。     

信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌的调控作用

[目的]研究信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌(APEC)的调控作用.[方法]采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响.Real-time PCR检测AI-2对APEC毒力基因转录水平的影响.活菌计数法观察AI-2对APEC黏附和入侵鸡胚成纤维细胞DF-1的影响.[结果]AI-2在浓度为0.185 mmol·L-1时,生物被膜形成能力显著增强,而浓度为0.037mmol· L-1和0.285mmol·L-1时,生物被膜形成能力无显著变化.Real-time PCR结果显示加入AI-2后,APEC毒力基因pfs,vat,luxS,tsh,fuyA,iucD转录水平显著下调,ompA和iss则上调.加入AI-2后,APEC对DF-1细胞的黏附和入侵能力分别下降到原来的57.35％和36.64％.[结论]AI-2对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成具有浓度依赖性,在适宜浓度下能显著增强.AI-2能减弱禽致病性大肠杆菌毒力基因的转录水平和对DF-1的黏附和入侵能力.表明AI-2参与调控APEC致病性.     

肠炎沙门菌hcp基因缺失株的体内致病性研究

将肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因缺失株CMCC(B)50336Δhcp和SD-2Δhcp分别皮下接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,通过半数致死量(LD50)测定比较它们与野生株50336、SD-2以及相应回补株50336Δhcp/phcp和SD-2Δhcp/phcp的致病性差异。结果表明:缺失hcp基因后,肠炎沙门菌50336Δhcp和SD-2Δhcp对小鼠的LD50分别为79.43和125.89cfu,对雏鸡的LD50分别为89.13×107和158.49×107 cfu;回补hcp基因后,50336Δhcp/phcp和SD-2Δhcp/phcp对小鼠的LD50分别为50.12和19.95cfu,对雏鸡的LD50分别为56.23×107和39.81×107 cfu;而亲本株50336和SD-2对BALB/c小鼠的LD50分别为19.95和7.94cfu,对雏鸡的LD50分别为25.12×107和14.13×107 cfu。试验证明相应回补株在BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡的致病力及体重影响指标上与亲本株基本接近,肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因对肠炎沙门菌的致病性具有增强作用。     

禽致病性大肠埃希菌及其PhoP/Q缺失株对鸡小肠内AvBD6的诱导表达

【目的】分析雏鸡感染禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)及其PhoP/Q缺失株后β-防御素6(AvBD6)在小肠内的分布和表达规律。【方法】将14日龄雏鸡随机分为对照组、APEC攻毒组和PhoP/Q缺失株攻毒组,其中对照组雏鸡腿肌注射生理盐水0.5mL/只,APEC和PhoP/Q缺失株攻毒组雏鸡腿肌分别接种相同剂量1×106 CFU/mL的菌液,分别于攻毒后0,6,12,24,36和48h采集各组鸡小肠样品,用荧光定量PCR(FQPCR)方法对各组织内AvBD6mRNA的表达量进行检测,同时采用免疫组化(IHC)技术对AvBD6蛋白分布进行观察。【结果】FQ-PCR结果显示,感染后24~48h,APEC攻毒组雏鸡十二指肠、空肠、回肠的AvBD6mRNA表达量显著高于对照组(P0.05),于48h达到峰值且显著高于0h(P0.05);在同一时间下,PhoP/Q缺失株攻毒组AvBD6mRNA的表达量显著高于APEC攻毒组(P0.05)。IHC结果显示,AvBD6主要分布于各小肠段的绒毛上皮细胞和肠腺部分。【结论】APEC能够诱导雏鸡肠道内AvBD6的表达,且PhoP/Q可能参与APEC调控AvBD6的抗感染作用。     

生物膜、毒力基因和耐药基因对ApEC的致病性作用

禽致病性大肠杆菌病(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是危害养禽业发展的主要细菌性病原之一,给养禽业的发展带来了严重危害。为研究APEC的致病性与耐药性之间的关系,从毒力基因的分布、生物膜的形成能力、耐药基因的分布等三个方面探讨了生物膜的形成能力与毒力基因、耐药基因在致病性中的作用,为后期研究禽大肠杆菌的致病机理及耐药机制等提供理论基础,并为开展禽大肠杆菌病的流行病学调查及监测、防控禽大肠杆菌病的流行提供理论数据。