珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。     

荷斯坦奶牛随机扩增多态DNA(RAPD)反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为试验材料,研究了Mg2 浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2 浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合物浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2 和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选.结果确定了星星草ISSR PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存.20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2 2.0mmol/L.     

假俭草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以假俭草为材料,对影响ISSR—PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合假俭草ISSR—PCR分析的最佳反应体系。表明在20弘L总体积中,包含40ng模板DNA、ISSR引物0．4umol／L、dNTPs0．1mmol／L、Mg^2＋1．0mmol／L、0．1U TaqDNA聚合酶和10×buffer 2．0uL。扩增条件为．94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1．5min,35个循环;72℃延伸7min。     

山羊基因组DNA RAMP-PCR反应体系的建立

以山羊基因组DNA为材料,研究了MgCl2浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量对RAMP-PCR反应的影响.建立了一套适合山羊的最佳RAMP反应体系.反应总体积为25μL,MgCl2浓度2.0 mmol/L、引物为0.4 mmol/L、dNTP浓度为0.2 mmol/L、模板DNA为25 ng,TaqDNA聚合酶为1U.PCR反应程序为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,40℃ 45s,72℃ 90s,30 Cycles;72℃ 10 min.     

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以内蒙古呼和浩特市近郊野生马蔺DNA为模板,采用均匀设计,通过5因素5水平和5因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度等)进行优化筛选,建立了适合马蔺的最佳ISSR-PCR反映体系:在25μl反应体系中,包括2.5μl 10×PCR Buffer、2.0mmol/L Mg2+、2.5μmol/L dNTP、1μmol/L引物1、.5U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA。在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性3min;然后进行40个循环(94℃变性45s,52.3～60.5℃退火30s,72℃延伸1.5 min);循环结束后,72℃延伸5min。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

多花胡枝子基因组DNA提取与RAPD反应体系优化

以多花胡枝子干种子、萌发种子及开花期叶片三种材料提取基因组DNA,其中开花期叶片用CTAB法提取、干种子和萌发种子用SDS法提取的DNA均用于RAPD研究。结果表明,叶片基因组DNA的RAPD扩增最佳反应体系是:DNA模板用量为75ng,Mg²⁺浓度2.1mmol/L,dNTP浓度200μmol/L,随机引物浓度为0.2pm/μL,10×buffer2.5uL,TaqDNA聚合酶1.5个单位,反应总体积25uL;扩增反应程序:94℃预变性3min;94℃变性30s,36℃退火30s,72℃延伸1min,循环45次,72℃延伸10min。     

东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

早熟禾ISSR反应体系的优化

以早熟禾基因组DNA为模板.利用正交设计,对影响ISSR反应体系的主要因素(Mg2+、dNTP、Taq酶)从4个水平上进行筛选和优化,建立了适合早熟禾的最佳ISSR反应体系:25μl反应体系中1.25U Taq酶、1.5mmol/L Mg2+,10×PCR Buffer 2.5μl、0.4 mmol/L dNTP、1μl引物、1μl DNA模板.扩增程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,56.4℃退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存.在此反应体系下,可以得到重复性好、稳定且多态性高的条带.     

铜绿假单胞菌flgE基因PCR检测方法的初步建立

为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。     

垂穗披碱草ISSR反应体系的正交优化

以垂穗披碱草(Elymus nutans)基因组DNA为模板,对ISSR-PCR反应体系中5个因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)进行优化试验.建立垂穗披碱草稳定的ISSR-PCR反应体系及最佳扩增程序.在25 μL反应体系中,最佳反应体系为2.5 μL 10×buffer(不含Mg2+)...     

山生柳SSR-PCR反应体系优化

本研究以祁连山4个海拔梯度的山生柳（Salix oritrepha）为材料,采用L9(34)正交试验设计和单因子试验,分析山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物SHUK123的适宜退火温度进行优化。结果表明,PCR反应体系的最佳条件:20 μL体系中2.0 mmol·L-1 Mg2+ 1 μL,0.10 mmol·L-1 dNTPs 1.5 μL,0.5 U Taq酶用量为1 μL,20 ng·μL-1 DNA模板1 μL, 0.5 μmol·L-1的上下游引物各2 μL,10× Taq Buffer 2 μL,ddH2O加至20 μL。扩增反应程序：94 ℃高温预变性时间3 min,94 ℃变性45 s,Tm(不同退火温度)退火时间45 s,72 ℃延伸30 s,循环数30个,最后72 ℃后延伸时间5 min,4 ℃保温。适宜退火温度为56 ℃。以上结果表明,此反应体系在山生柳PCR扩增中的稳定性和可重复性较好。     

槲树DNA SSR-PCR反应体系的正交优化

利用正交设计L16(45)对槲树(Quercus dentata Thunb.)基因组DNASSR-PCR反应体系的5个因素(Tap酶,Mg2+,,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了槲树模板DNASSR-PCR反应的最佳体系(20μL):60ng模板DNA,2mmol/LMg2+,0.075U/μLTaq酶,0.4mmol/L dNTP,引物浓度0.1μmol/L。对槲树DNASSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行了梯度试验,最佳退火温度为51.3℃。     

小叶锦鸡儿SSR-PCR体系优化及应用

为建立适宜小叶锦鸡儿（Caragana microphylla）SSR PCR的反应体系,利用正交试验设计L16(45),对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度进行五因素四水平优化筛选,确立最佳反应体系和扩增程序。即在25 μL反应体系中包括：40 ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,300 μmol/L dNTP,0.6 μmol/L引物,1 U Taq DNA聚合酶,1×Buffer。扩增反应程序为：94℃10 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10个循环,每循环的复性温度递减1℃;94℃ 45 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。应用该优化体系对小叶锦鸡儿种质资源及不同引物进行了检验及筛选。本研究表明,该体系的建立为今后利用SSR标记对小叶锦鸡儿属遗传多样性研究、遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究工作提供依据。     

鸡细小病毒与禽呼肠病毒二重PCR检测方法的建立

建立可同时检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)与禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)的二重PCR方法,为防控ChPV与ARV提供技术支撑。根据鸡细小病毒NS1基因和禽呼肠病毒σC基因的保守序列,设计合成两对引物用于检测ChPV和ARV,通过优化二重PCR的反应体系,特异性、敏感性试验评价建立的ChPV与ARV二重PCR。优化后的二重PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5μL,其中ChPV与ARV的上、下游引物各1.0μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足25μL;最佳的反应程序为:95℃5min;95℃1min,56.1℃1min,72℃1min,35个循环;最后72℃延伸10min。结果显示,建立的二重PCR能够同时扩增出204bp ChPV和405bp ARV片段;该方法对ChPV与ARV的检测敏感性分别达到58fg和53fg,但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增,对ChPV与ARV混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR检测结果符合率为94%以上。建立的二重PCR可用于ChPV与ARV感染的快速鉴别诊断。     

藏獒RAPD-PCR反应体系的优化

以藏獒血液为试验材料,提取基因组DNA后,对藏獒RAPD反应体系进行了优化。结果表明,20μL的最佳反应体系为:2.5 mmol/LMg2+、0.6 mmol/L dNTP、50 ng模板DNA、1.25UTaq酶和0.3μmol/L引物;藏獒RAPD反应的最佳退火温度为36.5℃。