Myf5基因在不同时期绵羊胎儿半腱肌和背最长肌中的表达及生物信息学分析

为了研究MRFs家族中Myf5基因在不同发育时期绵羊胎儿骨骼肌中的表达规律及分子特性,实验采取妊娠30 d(E30)、50 d(E50)和70 d(E70)3个时期绵羊胎儿的半腱肌和背最长肌,用HE染色法观察了其显微结构,通过实时荧光定量PCR技术检测了Myf5基因的表达变化,同时运用生物信息学软件对绵羊Myf5蛋白的...     

肌肉生长抑制素在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达

本试验旨在探究肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达情况，分别选取幼年（7日龄）、性成熟（21~28日龄）、体成熟（42~56日龄）和老年（84日龄以上）4个发育阶段的健康小鼠（各3只）为研究对象，采用实时荧光定量PCR、HE染色、免疫组织化学等方法研究小鼠不同发育时期MSTN基因在心肌组织中的表达及不同时期心肌组织的发育。实时荧光定量PCR结果显示，MSTN基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中均有表达，且其在小鼠老年时期的表达量最高，体成熟时期的表达量最低；幼年小鼠和性成熟小鼠心肌组织中MSTN基因表达水平显著低于老年小鼠（P<0.05），而体成熟小鼠则极显著性低于老年小鼠（P<0.01）。HE染色结果显示，小鼠心肌细胞核及肌纤维的生长在不同发育时期明显不同，其中幼年时期的细胞核最多，肌纤维排列相对较紧密，而在性成熟、体成熟、老年时期心肌的发育指标依次降低。免疫组织化学结果显示，MSTN基因主要在心肌细胞核中表达，其各个时期表达量与实时荧光定量PCR的结果相符合。     

m6A甲基化在鸡肌肉生长发育中的表达研究

试验旨在研究RNA m6A修饰相关基因去甲基化酶Alk B同源蛋白5（Alk B homologue 5，ALKBH5）、去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）、甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）和成肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumor 1-associating protein，WTAP）在鸡骨骼肌发育过程中的表达，分析其与骨骼肌m6A甲基化水平的相关性。首先，利用实时荧光定量PCR技术检测m6A甲基化相关基因在金茅花鸡12（E12）、14（E14）、16（E16）、18（E18）胚龄和1日龄腿肌和胸肌组织中mRNA表达水平，以及其在鸡成肌细胞50%、100%增殖期和1、2、3、4、5 d分化期的mRNA表达水平；随后，利用m6A甲基化试剂盒检测金茅花鸡E12和1日龄腿肌和胸肌组织中m6A甲基化修饰水平，与m6A甲基化相关基因表达水平进行相关性分析。结果显示，m6A去甲基化基因ALKBH5和FTO mRNA表达水平在骨骼肌发育过程中显著上调（P<0.05），即在E12、E14低表达，E16、E18逐渐上调，1日龄达到最高。m6A甲基化写入基因METTL14、METTL3和WTAP mRNA表达水平在E12、E14、E16逐渐上升，E18下降，随后至1日龄表达量回升。在细胞增殖过程中，ALKBH5、FTO、METTL14、METTL3和WTAP基因表达均上调；在细胞分化过程中ALKBH5和FTO基因表达水平显著上调（P<0.05），在分化第5天达到最高。METTL14、METTL3和WTAP基因mRNA表达水平在细胞诱导分化的1、2、3、4 d表达量呈下降趋势，而在诱导分化的第5天有所回升。甲基化水平检测结果显示，腿肌和胸肌m6A甲基化水平变化趋势一致，均在胚胎发育过程中显著下降（P<0.05），至1日龄达到最低。相关性分析结果显示，鸡骨骼肌RNA m6A甲基化水平与m6A去甲基化修饰基因ALKBH5、FTO mRNA表达水平呈显著负相关（P<0.05）。综合以上试验结果，推测m6A甲基化修饰与鸡骨骼肌发育相关，而去甲基化基因ALKBH5、FTO可能通过调控RNA m6A甲基化水平，影响鸡骨骼肌发育。本研究结果为进一步研究m6A甲基化修饰调控鸡骨骼肌生长发育的功能和分子机制提供理论依据。     

豫西黑猪不同屠宰体重肌纤维组织学及成肌调控基因发育性变化

【目的】试验旨在揭示豫西黑猪背最长肌肌纤维组织学、肌纤维类型和成肌调控相关基因发育性变化及其相互之间的关系。【方法】选取平均体重约为60、75、90、105和120 kg共5个体重阶段的豫西黑猪，每个体重屠宰3头，共15头，公母随机。采用HE染色和免疫荧光染色分析快慢肌类型组成和纤维组织学特性，利用实时荧光定量PCR方法测定成肌调控相关基因生肌决定因子（myogenic differentiation，MyoD）、配对盒7（paired-box 7，Pax7）、肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）、肌细胞生成素（myogenin，MyoG）、肌细胞增强因子2C （myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）和肌纤维肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）亚型的mRNA表达量。【结果】随着豫西黑猪体重的增加，肌纤维密度整体呈下降趋势，在75 kg时极显著高于其他体重阶段（P<0.01），肌纤维面积和肌纤维直径整体呈上升趋势；慢肌面积占比在60和105 kg时显著或极显著低于其他体重阶段（P<0.05；P<0.01），快慢肌所占面积总百分比在90 kg时极显著低于其他体重阶段（P<0.01）。实时荧光定量PCR检测结果发现，MyHCⅠ基因mRNA表达量在75和105 kg时极显著高于其他体重阶段（P<0.01），MyHCⅡA基因mRNA表达量整体呈下降趋势，MyHCⅡX基因mRNA表达量在60 kg时达到最高，而MyHCⅡB基因mRNA表达量在75 kg时极显著低于其他体重阶段（P<0.01）；MyoD、Pax7、MSTN、MyoG、MEF2C基因mRNA表达量分别于60、75、90、120、120 kg时达到最大值。相关性分析结果表明，除MSTN基因外，MyoG、MyoD、Pax7和MEF2C基因均与肌纤维形态和MyHC基因各亚型之间有显著或极显著的相关性（P<0.05；P<0.01）；通过对120 kg的豫西黑猪和杜洛克猪比较发现，两者间肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维密度，以及MyHC和相关成肌调控基因mRNA表达量均有极显著差异（P<0.01）。【结论】在豫西黑猪60~120 kg生长阶段，肌纤维面积、肌纤维直径整体呈上升趋势，肌纤维密度呈下降趋势；在肌肉发育过程中，纤维类型组成的变化主要是Ⅰ、ⅡA、ⅡX型肌纤维向ⅡB型肌纤维的转化；与杜洛克猪相比，豫西黑猪肌纤维面积和肌纤维直径较大，肌纤维密度较低，MyHCⅠ与MyHCⅡA基因mRNA表达量较高。     

基于转录组数据挖掘藏羊立毛肌发生的关键基因

旨在探究调控藏羊皮肤内立毛肌发生的分子机制，挖掘影响立毛肌发生的关键基因。本研究采集了30个75~110日龄健康情况良好的藏羊胚胎，收集背部皮肤组织，制作石蜡组织切片，利用HE染色观察背部皮肤内不同日龄立毛肌的形态学变化特征，推测出立毛肌发生的关键时期为胚龄75~85天（E75~E85）；分别挑选胚龄大约在75和85天各3个背部皮肤组织样品，分样品提取RNA，利用Illumina Hiseq平台进行转录组测序，对测序数据进行质控、过滤、比对，筛选得到差异表达基因，并对差异基因进行功能注释、富集分析、蛋白网络互作和RT-qPCR验证，挖掘调控立毛肌早期发育的关键候选基因。测序结果共得到1 159个差异表达的基因（P<0.05），其中900个基因上调，259个基因下调。随机选择6个差异表达的基因进行RT-qPCR验证，表达趋势与转录组测序结果一致，表明测序结果可靠。通过对差异基因进行GO功能注释和KEGG富集分析，筛选到与立毛肌发育相关的5个生物学过程条目和5个信号通路共47个非冗余基因（如BAMBI、TNNI3、HOXA9等）。本研究表明，藏羊立毛肌开始发育的关键时期约为E75~E85天，该时期内SPP1、BAMBI、TNNI3、HOXA9、SOX15可能为影响藏羊立毛肌发生的关键候选基因。     

外源注射miR-499-5p对肉鸡腓肠肌转录组的影响

旨在探讨外源注射miR-499-5p对肉鸡腓肠肌肌纤维直径及基因表达的影响，完善miR-499-5p对肉鸡骨骼肌发育的分子调控机制。本研究选用14日龄健康大恒肉鸡公鸡16只，随机分为2组，每组8个重复，均正常饲喂日粮，分别在腓肠肌部位肌肉注射agomiR-NC（对照组，5 nmol）和agomiR-miR-499-5p（注射组，5 nmol），为保证试验效果，每3 d注射1次，共注射6次。注射完成后将16只肉鸡屠宰，采集腓肠肌组织进行肌纤维直径测定和转录组学（RNA-seq）分析。结果显示，注射miR-499-5p可导致肉鸡腓肠肌肌纤维直径显著减小（P<0.05）。转录组测序结果显示，注射组和对照组分别获得308 263 164和316 696 152条clean reads，与鸡参考基因组的比对率分别为90.29%和89.57%。与对照组相比，注射组共有差异表达基因18个，其中上调基因12个，下调基因6个（P<0.05）。其中差异表达最大的两个基因分别是原癌基因FOS（fos proto oncogene，FOS）和早期生长应答蛋白基因（EGR1）。GO富集分析发现，差异表达基因显著富集于跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路、转录调控、脂质合成和骨骼肌再生等过程。KEGG富集分析结果显示，差异表达基因显著富集于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和Wnt信号通路。利用生物信息学软件预测到miR-499-5p的靶基因共78个，GO富集分析发现，靶基因也显著富集于丝氨酸/苏氨酸激酶活性的负调控和转录因子活性等过程。本研究表明，注射miR-499-5p可改变肉鸡腓肠肌肌纤维直径从而影响肌纤维特性，差异表达基因中的FOS、EGR1、CYR61和WNT7A基因可能在miR-499-5p的作用下通过上述通路参与了脂肪沉积和肌肉发育的调控。     

FST和FMOD基因在绵羊胎儿妊娠中后期的表达特征比较

本研究以骨骼肌表型差异明显的两个绵羊品种特克塞尔羊和乌珠穆沁羊为试验对象,通过对两个与生长发育相关的基因卵泡抑素(follistatin,FST)与纤维蛋白聚糖基因(fibromodulin,FMOD)在不同日龄、不同骨骼肌部位表达的比较分析,探讨绵羊骨骼肌早期发育规律;同时对绵羊胎儿的85、100、120和135日龄4个阶段,在背最长肌、半腱肌、股四头肌、半膜肌和股二头肌5个部位肌肉FST和FMOD基因的表达量进行了比较研究。实时荧光定量PCR结果表明,随着胎儿日龄的增加,FST基因在半腱肌、股四头肌中表达量有增加的趋势,同时在特克塞尔绵羊中的表达量高于乌珠穆沁羊。在100和120日龄半腱肌、120日龄半膜肌、120日龄股二头肌中FST基因表达量在两个品种间差异显著(P<0.05),在100和135日龄半膜肌、85日龄背最长肌、100日龄股四头肌、100日龄股二头肌中FST基因表达量在两个品种间差异极显著(P<0.01)。FMOD基因在股四头肌中表达量较高,而在其他4种肌肉组织中相对表达量较低,且在乌珠穆沁羊中的表达量高于特克塞尔羊中的表达量。FST和FMOD基因在绵羊早期骨骼肌发育中起着重要作用。     

五指山猪与长白猪65 d胎儿组织MRFs家族基因的表达研究

 
以五指山猪和长白猪妊娠65 d胎儿腿部骨骼肌、背部骨骼肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、胃、脑10种组织为材料,采用qPCR技术,检测和研究MRFs基因家族成员（包括MyoD1、Myf4、Myf5和Mfy6基因）在以上10种组织中的mRNA表达水平及差异。结果表明：（1）MRFs家族成员除肝、肾、肠组织以外,在五指山猪65 d猪胎儿组织中mRNA表达水平均高于长白猪相应组织中的表达水平（P<0.05）;（2）MRFs家族成员表达水平在腿肌和背肌中的表达普遍偏高,其他组织中表达较低（P<0.05）;（3）2个猪种在以上10种组织中MRFs家族mRNA表达水平的高低分布基本一致,其相对表达量顺序为：腿部骨骼肌＞背部骨骼肌＞肝＞肺＞胃＞脾＞脑＞肾＞肠＞心。     

中国美利奴羊胚胎骨骼肌发育的加权基因共表达网络分析

旨在对绵羊胚胎骨骼肌lncRNAs（long non-coding RNA）进行鉴定分析,以阐明其在肌纤维类型转换与肌纤维增粗过程中的调控机制。本研究选取体重相近的成年中国美利奴母羊进行同期发情和人工授精,通过全转录组测序技术对其妊娠第85（D85N）、105（D105N）和135天（D135N）的胎儿背最长肌组织进行测序,设置D85N vs D105N、D105N vs D135N和D85N vs D135N 3个比较组,通过比较筛选出显著差异表达的lncRNA与mRNA。利用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）方法构建共表达模块,使用DAVID在线工具和R-package进行GO和KEGG富集分析以找到与肌肉发育相关的模块。最后从目标模块中筛选出高连通度的lncRNAs和mRNAs,通过它们与miRNAs间的靶向预测关系建立lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络。根据WGCNA分析结果,共得到25个模块。功能富集显示,模块中的核心基因主要富集于细胞粘附、Wnt、紧密连接、mTOR、AMPK及ECM-受体相互作用等肌肉发育相关的信号通路,选出模块中连通度高的lncRNAs和mRNAs构建子网络,得到TNNI2、PIP5K1A、PDK4等关键相关基因,预测出MSTRG.3903、MSTRG.10154、MSTRG.1629、MSTRG.10496、MSTRG.9559、MSTRG.10178、MSTRG.10521、MSTRG.3911、MSTRG.4586、MSTRG.7232等10个与肌肉发育、肌肉疾病、细胞增殖相关的lncRNAs。本研究成功构建了肌纤维发育相关的lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络,找到多个与妊娠后期胚胎骨骼肌发育相关的潜在候选基因,为深入研究lncRNA在中国美利奴羊胚胎发育过程中骨骼肌的发育调控机制奠定了基础,也为其他家畜骨骼肌发育机制的研究提供了参考和方向。     

肌肉生长抑制素在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达

本试验旨在探究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达情况,分别选取幼年(7日龄)、性成熟(21~28日龄)、体成熟(42~56日龄)和老年(84日龄以上)4个发育阶段的健康小鼠(各3只)为研究对象,采用实时荧光定量PCR、HE染色、免疫组织化学等方法研究小鼠不同发育时期MSTN基因在心肌组织中的表达及不同时期心肌组织的发育。实时荧光定量PCR结果显示,MSTN基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中均有表达,且其在小鼠老年时期的表达量最高,体成熟时期的表达量最低;幼年小鼠和性成熟小鼠心肌组织中MSTN基因表达水平显著低于老年小鼠(P0.05),而体成熟小鼠则极显著性低于老年小鼠(P0.01)。HE染色结果显示,小鼠心肌细胞核及肌纤维的生长在不同发育时期明显不同,其中幼年时期的细胞核最多,肌纤维排列相对较紧密,而在性成熟、体成熟、老年时期心肌的发育指标依次降低。免疫组织化学结果显示,MSTN基因主要在心肌细胞核中表达,其各个时期表达量与实时荧光定量PCR的结果相符合。     

Expression of Myogenic Regulatory Factors in Myocardium and Skeletal Muscle at Different Fetal Stages

The topic of this research was to investigate the expression pattern of myogenic regulatory factors (MRFs) in the myocardium and skeletal muscle of sheep at different fetal stages,the fetuses of Tan sheep at 60 (E60),70 (E70),80 (E80) and 90 days (E90) of gestation were selected as the research objects,and the myocardium and skeletal muscle were collected.The histogenesis of myocardium and skeletal muscle during fetal development were observed by HE and oil red staining.The expression patterns of MRFs in myocardium and skeletal muscle during fetal development and the expression differences of MRFs between myocardium and skeletal muscle at the same stage were tested by Real-time quantitative PCR.The results of HE staining showed that the microstructure of myocardium and skeletal muscle was very different,myocardial fibers crisscross into a network with high density,which were more mature;the density of skeletal muscle fibers were low with large gaps,the number of fibers from E60 to E90 increased gradually,and the structure fiber bundles was very clear.The results of oil red staining showed that there were no fat droplets stained red in myocardium and skeletal muscle tissues,which means that these two tissues form E60 to E90 did not have fat differentiation.The results of Real-time quantitative PCR showed that the expression of MYOG,Myf5 and Myf6 genes in myocardium decreased continuously from E60 to E90 day,but there was no MYOD gene expression.The expression of MYOD,MYOG and Myf6 genes in skeletal muscle from E60 to E90 increased gradually,among which the level of MYOG gene was the highest,and the expression of Myf5 gene fluctuated periodically.The above results indicated that the skeletal muscle was at the stage of rapid development from E60 to E90,however,the myocardial tissue had been roughly formed,which led to the expression of MRFs in skeletal muscle tissue was much higher than that in myocardial tissue,and MYOG gene played an important role in maintaining the rapid development of skeletal muscle.     

Expression Analysis of THBS3 Gene in Different Tissues and Skeletal Muscles at Different Periods from Landrace and Tongcheng Pigs

To study the expression pattern of THBS3 gene in different tissues and during skeletal muscle development, the THBS3 gene expression in different tissues and skeletal muscles during prenatal periods (33, 45, 65, 70 and 90 d) and postnatal periods (0, 9, 30, 60, 120 and 160 d) from Landrace and Tongcheng pigs were detected by Real-time quantification PCR.The results showed that THBS3 gene widely expressed in all tissues examined, exhibiting similar spatial expression patterns with expression peaks in lung in both pig breeds except in stomach and intestine.Moreover, although THBS3 gene showed a significant higher expression level in gestation than after birth in Landrace and Tongcheng pigs (P<0.05), it exhibited different expression patterns between Landrace and Tongcheng pigs, the expression peak was detected at gestation day 45 in Landrace pig, while was detected at gestation day 65 in Tongcheng pig.The results suggested that THBS3 gene involved in skeletal muscle growth and development in pigs, as well as the regulation of asynchronization of skeletal muscle development in different pig breeds.     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】 研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】 利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%~70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin,myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用双荧光素酶测定miR-495-3p与其靶基因的结合情况。【结果】 生物信息学预测结果表明,miR-495-3p的靶基因为心肌肌动蛋白α1(alpha cardiacactin 1,ACTC1),且miR-495-3p和ACTC1在1和10月龄山羊背最长肌中表达量均差异极显著(P<0.01)。miR-495-3p和ACTC1在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌6种组织中均有表达,在背最长肌中表达量较高。细胞转染结果表明,miR-495-3p mimic极显著促进miR-495-3p的表达(P<0.01),miR-495-3p inhibitor极显著抑制miR-495-3p的表达(P<0.01),说明miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor可用于后续试验。实时荧光定量PCR结果表明,过表达miR-495-3p促进骨骼肌细胞分化相关标志基因MyoG、Myf5的表达,抑制miR-495-3p则降低MyoG、Myf5基因的表达;过表达、干扰miR-495-3p对Pax7、Cyclin E基因的表达及细胞增殖活力均无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶报告结果表明,miR-495-3p与ACTC1基因存在靶向关系。【结论】 miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞的增殖无显著影响,但可通过靶向ACTC1基因促进山羊骨骼肌细胞分化。     

THBS3基因在长白猪和通城猪不同组织和不同时期骨骼肌中的表达分析

本研究主要探究血小板反应蛋白3 (thrombospondin-3,THBS3)基因在不同组织及不同时期骨骼肌生长发育过程中的表达规律。利用实时荧光定量PCR方法对THBS3基因在长白猪和通城猪中的组织表达谱,以及在胚胎期(33、45、65、70和90 d)和出生后阶段(0、9、30、60、120和160 d)骨骼肌中的差异表达进行了比较分析。结果表明,THBS3基因广泛表达于长白猪和通城猪各个组织器官,除胃和肠中的表达存在差异外,其在两个猪种中的组织表达谱基本一致,在肺脏中表达量最高。THBS3基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段(P<0.05),但胚胎期骨骼肌中的表达模式在两个猪种间存在一定差异,THBS3基因表达峰值出现在长白猪胚胎期45 d,而其在通城猪中表达峰值出现在胚胎期65 d。结果提示,THBS3基因参与了猪骨骼肌生长发育过程及不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控。     

不同种类脂肪酸对延边黄牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响

试验旨在探究用同一浓度不同种类的脂肪酸单体（油酸、硬脂酸、棕榈油酸及棕榈酸）处理延边黄牛骨骼肌卫星细胞（BSC）,研究其对脂肪生成相关基因表达及脂滴形成的影响。从18月龄延边黄牛半膜肌中分离提取骨骼肌卫星细胞进行体外培养,在分化培养基中分别添加100 μmol/L油酸（OA）、硬脂酸（SA）、棕榈油酸（POA）和棕榈酸（PA）培养96 h,油红O染色观察脂滴生成情况,并利用实时荧光定量PCR法检测与脂肪生成相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、固醇调节原件结合蛋白1（SREBP1）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）的表达。油红O染色结果显示,与对照组相比,所有的脂肪酸处理组细胞均有脂滴形成,油酸和棕榈油酸处理组相对于棕榈酸和硬脂酸处理组在肌管内形成的脂滴数量更多,且脂滴的形态较大。实时荧光定量PCR结果显示,在延边黄牛骨骼肌卫星细胞中添加油酸和棕榈油酸等不饱和脂肪酸增加了与脂肪合成相关基因PPARγ、SREBP1、C/EBPα的表达,抑制了SCD基因的表达;添加饱和脂肪酸（硬脂酸和棕榈酸）则在促进PPARγ、SREBP1、C/EBPα基因表达的同时也显著增加了SCD基因的表达（P < 0.05）。结果表明,添加脂肪酸可以诱导延边黄牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell，BSSC），并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC，使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC，使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力，使用2%马血清诱导其分化为肌细胞，RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现，分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形，细胞形态饱满，折光性强，随着培养时间的延长，细胞由原来的无序生长变为有序生长；RT-PCR检测发现，BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达；免疫荧光染色及Western blotting结果显示，PAX7和MyoD基因均呈阳性表达；成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现；成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后，而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上，本研究成功分离获得BSSC，并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。