大豆子叶节再生体系的优化与农杆菌转化的研究

以大豆子叶节为外植体,采用农杆菌介导法将目的基因Cry1Ac导入大豆中。结果表明,卡那霉素抗性植株经PCR检测,初步证明外源基因Cry1Ac已经整合到大豆基因组中,并从灭菌方法、6-BA对出芽率的影响、大豆基因型、卡那霉素筛选方式及选择压力等方面优化了大豆植株再生体系。     

转亚洲Ⅱ型口蹄疫病毒VP1基因烟草研究

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。     

转亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因烟草研究

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。     

苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因导入大豆后代的筛选

采用液滴法和注射法，将带有苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因的质粒ＤＮＡ导入自花授粉后的大豆品种鲁豆４号和８６１３８７—２。提取Ｄ１代大豆叶片的ＤＮＡ，与苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因进行了斑点杂交，从Ｄ１代４４０个植株中，选出７个杂交阳性后代，表明苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因已整合于大豆基因组中。本文还对外源ＤＮＡ导入后代筛选中存在的问题进行了讨论。     

Na~+转运蛋白SKC1基因转化大豆的研究

本研究构建了水稻Na+转运蛋白SKC1基因植物表达载体pTF-SKC1,标记基因为Bar基因。以子叶节为外植体,利用农杆菌介导法将SKC1导入大豆中。经过除草剂抗性筛选后获得的再生植株经PCR方法鉴定,转基因植株阳性率为50%,初步证明SKC1基因已整合到大豆基因组中。耐盐性试验结果表明,转基因植株的耐盐性高于对照。     

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化大豆的研究

本研究利用农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入大豆,以提高大豆的耐盐性。对132棵转化植株进行了PCR检测,获得64棵阳性植株,阳性率达到48%。对PCR阳性植株进一步进行Southern杂交分析,证明BADH基因已经整合到大豆基因组中。     

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

[目的]筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据.[方法]采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA 1301为基本载体,构建抑制大豆RACK基因表达的RNAi载体.通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测.[结果]克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIA1301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确.通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中.经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%.[结论]成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础.     

天花粉蛋白基因导入大豆的研究

为获得含有天花粉蛋白(TCS)的转基因大豆植株,提高大豆的抗病虫能力,进行了植物表达载体的构建及转入大豆的研究。首先构建植物表达载体p C-t Pro-TCS-GUS,将其转化E.coli DH5α,经SDS-PAGE结果表明:克隆得到的TCS基因可以在大肠杆菌中表达。通过根癌农杆菌介导法,将TCS基因导入大豆合丰35中,获得了19株T0代转基因大豆,转化率为1.033%。选取T0代种子种植在大田中共获得18株T1代转基因大豆,对获得的T0代和T1代转基因植株进行PCR和PCR-Southern检测,证实外源天花粉蛋白基因己经整合到大豆基因组中。     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料.[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因CrylC转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定.[结果]获得28株阳性大豆转化植株.[结论]初步认定CryIC基因已整合到大豆基因组中.     

农杆菌介导法转化大豆体细胞胚获得转基因植株

以六个品种大豆体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经卡那霉素选择、诱导体细胞胚萌发及壮苗培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。     

PSY基因对大豆的遗传转化

以3个大豆品种的体细胞胚为受体，以PSY为目的基因，应用基因枪法对大豆进行了遗传转化，经大豆体细胞胚的继代筛选培养、萌发培养、芽诱导培养、生根培养和潮霉素选择培养，获得了完整的抗性再生苗，经PCR和PCR-Routhern分析鉴定，初步证明外源PSY基因已整合到大豆的基因组中。     

根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究

通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株。PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组。GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%。     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。     

cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化

cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对绥农28大豆子叶节进行遗传转化,获得抗性株系8株。经PCR和RT-PCR检测结果证明,cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达。研究为抗大豆食心虫转基因育种产业化奠定基础。     

大豆胞囊线虫抗性候选基因Rhg1的克隆及其功能验证

大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode,SCN)是大豆生产上一种危害严重的世界性害虫,给大豆的产量和品质造成极大的损失。大豆抗性品种选育是其防治措施中最经济、有效的方法。文章拟利用RT-PCR方法克隆得到大豆胞囊线虫抗性候选基因Rhg1,通过构建植物过量表达载体pCAMBIA3301/Rhg1,并采用根癌农杆菌介导的大豆子叶节方法转化大豆东农50。PCR检测草丁膦抗性植株,表明目的基因已经整合到了大豆基因组中;实时荧光定量PCR结果也进一步证实,目的基因在转基因植株中有较高水平的表达丰度。在胞囊线虫的侵蚀下,转基因植株体内的超氧化物歧化酶含量显著高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究证实了Rhg1为大豆胞囊线虫的主抗基因,同时为大豆胞囊线虫的分子抗性育种提供理论基础。     

Cloning of Soybean 24 kDa Oleosin Gene and Its Transient Expression as a Carrier for Foreign Protein

The genomic DNA sequence encoding soybean 24 kDa oleosin and its promoter were cloned and analyzed for investigation of the potentials of the oleosin acted as a carrier for production of recombinant proteins in plant. The -300 box, GA-rich, G-box, SEF-3, SEF-4, RY box, ABA box, CAn and TATA box were found in the upstream region of the soybean oleosin gene, which shows the functional oleosin promoter available. Homology comparison reveals that the soybean 24 kDa oleosin shares the highest identity with the soybean oleosin isoform A (U09118, GenBank), reaching to 98.4% in nucleotide. A soybean oleosinhirudin fusion gene driven by the oleosin promoter was constructed and inserted into plant binary expression vector. The intact tobacco plantlets were transformed by means of vacuum infiltration approach, with the Agrobacterium tumefaciens harboring the above vector. The transient correct expression of oleosin-hirudin fusion gene was identified by SDS/PAGE, western blotting and enterokinase treatment.     

抗真菌转基因大豆对大豆疫霉根腐病抗病性鉴定

采用下胚轴伤口接种法,对Southern杂交阳性的转菜豆几丁质酶基因和大麦核糖体失活蛋白基因的双价转基因大豆T2代的5个株系,进行了大豆疫霉根腐病抗病性检测,并通过比较接种后转基因大豆与对照组的死亡率来探讨两者的抗病性差异。结果表明,有4个转基因株系对大豆疫霉根腐病的抗性与非转基因对照组相比有明显提高,另外1个株系与对照组相比没有明显差异。