紫杉醇生物合成相关酶类的研究进展

紫杉醇(Taxus)是一种从红豆杉植物中提取出来的天然抗癌药物。笔者简要介绍了紫杉醇的化学结构和生物合成途径, 重点介绍了紫杉二烯合成酶、细胞色素P450单加氧酶、酰基转移酶和苯丙氨酸氨基变位酶等紫杉醇生物合成相关酶类的研究进展。     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

化感水稻PI312777响应低磷胁迫的差异蛋白质组学分析

为研究水稻响应低磷的分子机理,以化感水稻PI312777为材料,应用差异蛋白质组学方法分析化感水稻PI312777根部响应低磷的蛋白质组变化趋势.结果表明,共鉴定11个差异蛋白质点,共分为3类:第1类,与信号转导相关蛋白质-细胞色素B5、受体激酶;第2类,与生长相关蛋白质-推定叶绿体SPR接受子、CDC2蛋白激酶、生长素转运蛋白、脯氨酸富集蛋白家族;第3类,与化感物质代谢相关蛋白质-推定水杨酸羧基转甲基酶、推定4-香豆酸辅酶A连接酶、推定细胞色素P450、苯丙氨酸解氨酶、角鲨烯单氧化酶.其中除细胞色素B5和角鲨烯单氧化酶表达丰度下调,其余蛋白质表达丰度均上调.     

毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究

香豆酸-3-羟基化酶（C3H）是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H.PheC3H基因全长1 842 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白（PheC3H）,C端具有1个细胞色素P450蛋白（CYP450）特异的保守结构域。相似性比对显示, PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。     

工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究

细胞色素P450单加氧酶(P450BM3)能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸,在前期构建携带单加氧酶基因P450BM3工程大肠杆菌(Escherichia coli)转化脂肪酸的基础上,为解决外源脂肪酸在羟基化过程中的消耗和转运问题,构建了脂酰基辅酶A合成酶基因(fadD)缺失和外膜蛋白编码基因(fadL)过表达的工程菌株。摇瓶条件下羟基十二酸产量达到748.8 mg/L,转化率为93.6%。     

细胞色素氧化酶P450介导的昆虫抗药性研究进展

细胞色素氧化酶P450介导的昆虫抗药性研究有利于延缓或防止昆虫对杀虫剂产生抗性,延长杀虫剂的使用寿命。基于此,简要介绍昆虫细胞色素氧化酶P450的研究情况,以及昆虫抗药性与细胞色素氧化酶P450的关系,并对细胞色素P450介导抗性的分子基础进行介绍。     

利用RNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450

【目的】通过体外饲喂双链RNA（dsRNA）,利用RNAi技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450。【方法】采用PCR克隆获得麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450片段;利用双链RNA合成试剂盒合成麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA;在蚜虫人工饲料中,分别加入终浓度为0、3、5和7.5 ng•μL-1的dsRNA,每个试验组设置3个重复,分别于饲喂后2天、4天、6天、8天统计蚜虫的存活数;利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。【结果】从麦长管蚜与桃蚜的cDNA中分别克隆细胞色素P450,所克隆片段同源性为90.1%,发现随着dsRNA浓度的增大,麦长管蚜和桃蚜的死亡率随着时间的推移不断升高,最高死亡率可分别达75.56%和64.44%。提取饲喂dsRNA浓度为7.5 ng•μL-1的不同时间段的蚜虫总RNA,实时荧光定量PCR结果表明,目的基因被沉默。【结论】利用麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA,体外饲喂后,通过RNA干扰（RNAi）,能够显著降低蚜虫体内细胞色素P450的表达水平,直至导致目的基因沉默和蚜虫死亡。     

矮牵牛细胞色素b5蛋白编码基因difF的克隆及序列分析

以紫红色、蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)的花瓣为材料,提取总RNA,用Oligo(dT)作为引物反转录合成cDNA第一链:以此为模板,用Genebank上的矮牵牛细胞色素b5蛋白DIF-F(difF)的mRNA序列设计成的引物进行PCR扩增,扩增到一条约450 bp的片段,将此片段克隆到pGM-T载体上.对重组克隆进行序列分析,结果表明所克隆到的矮牵牛细胞色素b5蛋白的cDNA的编码区含有450个核苷酸,编码149个氨基酸残基;其核苷酸及氨基酸的序列与Genebank上的同源性分别达到99.93;和100;.     

人参皂甙Rbl对大鼠神经细胞表达蛋白质组的影响

[目的]研究人参皂甙Rbl对大鼠神经细胞表达蛋白质组的影响。[方法]常规培养大鼠神经细胞,将其随机分为2组,试验组加入5μg/ml Rbl,对照组加入等量的培养基,药物作用20 min,裂解细胞,提取全细胞蛋白。双向电泳(2-DE)分离提取物,用ImageMaster2D Platinum v5.0软件进行差异表达蛋白质组分析,基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白质。[结果]通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,试验组的2-DE图谱共检出蛋白斑点418个,其中226个为差异表达的蛋白斑点;经质谱鉴定,与Rbl作用相关的2个差异表达的蛋白斑点包括:细胞色素P-450、光导素样蛋白,它们均属于磷酸化蛋白质。[结论]该研究表明Rbl对大鼠神经细胞的作用极有可能是通过相应的细胞信号转导网络系统来实现的。     

两个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的克隆与分析

为了深入研究入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)对农药等外源物的作用机制,采用RACE的方法克隆了2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的开放阅读框序列.其中一个基因的开放阅读框包含1 536 bp的片段,编码512个氨基酸,其相对分子质量为59 843.5,理论等电点为8.79,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;其具有WXXXR(WKNLR)、EXXR(ETLR)序列及FXXGXXXCXG/A(FGEGPRICIG)血红色素结合位点等细胞色素P450特有的氨基酸序列,其中ETLR属于CYP6家族所特有,且其blast比对均与昆虫体内CYP6A家族的相似性较高,将其命名为PsCYP6a1.另一个基因的开放阅读框包含1 575 bp的片段,编码525个氨基酸,相对分子质量为61 246.62,理论等电点为8.87,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;与前者相似,也包含了相应的细胞色素P450基因的保守位点,将其命名为PsCYP6a2.2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的核苷酸序列的相似性为55.56%,氨基酸序列的相似性为39.41%,相似的残基占了44.12%.     

南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

[目的]克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据.[方法]采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能.[结果]克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸.TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%.TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体.TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中.TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达.大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累.[结论]不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用.     

烟实夜蛾细胞色素P 450 cDNA片段的克隆与序列分析

昆虫细胞色素P 450与昆虫抗药性关系密切,本研究以烟实夜蛾5龄幼虫中肠的总RNA为模板,设计并合成简并引物,利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出了烟实夜蛾细胞色素P 450基因的cDNA片段,将其克隆到pMD 18-T载体进行序列测定,测序得到的491 bp的片断编码163个氨基酸残基,且该片断在阅读框内.与已公布的谷实夜蛾、棉铃虫和烟芽夜蛾细胞色素P 450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为98.7%,98.7%和92.1%.     

烟实夜蛾细胞色素P 450 cDNA片段的克隆序列分析

昆虫细胞色素P 450与昆虫抗药性关系密切,本研究以烟实夜蛾5龄幼虫中肠的总RNA为模板,设计并合成简并引物,利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出了烟实夜蛾细胞色素P 450基因的cDNA片段,将其克隆到pMD 18-T载体进行序列测定,测序得到的491 bp的片断编码163个氨基酸残基,且该片断在阅读框内.与已公布的谷实夜蛾、棉铃虫和烟芽夜蛾细胞色素P 450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为98.7%,98.7%和92.1%.     

白菜核雄性不育两用系花蕾的mRNA差别显示及其cDNA差异片段分析

用mRNA差别显示技术对白菜核雄性不育两用系中不育株群与可育株群花蕾总RNA进行了比较分析.在6种反转录模板和20种差异随机引物共120种组合的选择扩增中共回收了18个cDNA差异片段,对其中6个cDNA差异片段进行Northern验证,获得了一个白菜核雄性不育两用系可育株群并在花蕾中特异表达的阳性差异片段,简称为B0302-4.Northern验证结果表明它在不育株中的表达受到了明显的抑制,其长度为463 bp.经GenBank BLAST查询,它与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素P450的基因CYP86C4核苷酸序列有84.3%的同源性.     

辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析

通过对辣椒细胞质雄性不育(CMS)系及其相应保持系育性相关基因的分析,检寻SNP位点,旨在探索其与辣椒细胞质雄性不育性的关系。以高盐-蛋白酶K法提取线粒体DNA,采用AFLP技术分析了辣椒不育系和保持系的mtDNA的差异,从128对引物扩增产物中发现了不育系和保持系的差异片段,经回收、克隆获得不育系特异片段CanLE长度140 bp,保持系特异片段CanLB长度126 bp。利用Blast对其进行序列比对分析,其中CanLE与细胞色素P450家族蛋白同源,CanLB和赖氨酰-tRNA合成酶同源。进一步分别克隆并获得了不育系和保持系辣椒细胞色素P450全长,序列分析发现,两者存在单核苷酸多态性(SNP),其中5个碱基差异,3个为同义突变,2个氨基酸发生改变。     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因的克隆及表达

【目的】克隆并鉴定金纹细蛾(Phyllonorycter ringoniella)细胞色素CYP6家族基因,并观察氯氟氰菊酯药剂处理后mRNA相对表达量的变化,为金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因全长cDNA的获得,以及防止或延缓金纹细蛾抗药性的产生提供理论依据。【方法】以GenBank上公布的CYP6家族基因编码区序列为基础设计并合成简并引物;利用RT-PCR扩增获得序列后在NCBI上进行Blastx对比,根据P450基因命名法进行命名并向GenBank提交序列获得登录号;利用点滴法和qRT-PCR技术,将金纹细蛾3龄幼虫在氯氟氰菊酯(LC50=12.88mg/L)条件下处理24h后,观察其体内细胞色素P450基因的相对表达量。【结果】成功扩增出3个长度分别为415,412和421bp的cDNA片段。同源性分析表明,3条基因序列与CYP6AN5、CYP6B5和CYP6ab氨基酸相似性分别达61%,59%和71%,可将其初步均归类为CYP6家族,并分别命名为phCYP6AN5、phCYP6B5和phCYP6ab,将序列信息提交至GenBank,获得GenBank登录号分别为KJ559411、KJ559412和KJ559413。药剂处理对3种基因发生了不同的诱导或抑制作用,phCYP6AN5基因在受到药剂处理后相对表达量显著上升,而phCYP6B5和phCYP6ab在受到药剂处理后相对表达量显著下降。【结论】成功获得3条金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因片段;诱导剂的诱导作用存在一定程度的特异性,对某种或几种P450酶有效应的化合物并不一定诱导其他类型的P450。     

苦蘵P450家族基因鉴定与表达分析

细胞色素P450酶(cytochrome P450)广泛参与植物次生代谢,是当前的研究热点。基于苦蘵转录组数据,分析并鉴定了部分苦蘵P450家族基因。共鉴定得到795个可能为P450家族基因的序列片段,并将它们聚类到25个不同的聚类(cluster)中,其中,有12个聚类具有组织特异性表达。最终拼接得到30个苦蘵P450家族基因的全长序列,它们与其他物种P450基因高度同源。进化分析表明,这30个苦蘵P450基因可归为9个P450亚家族。通过定量PCR技术,分析了多个P450基因在果实不同成熟阶段的表达变化。结果表明,9个P450基因随着果实成熟表达量上升,另外9个P450基因表达量则逐渐降低。以果实为材料,分析了P450家族基因在乙烯(ACC)与乙烯抑制剂(1-甲基环丙烯,1-MCP)处理下的表达变化。研究表明,部分P450家族基因在ACC和1-MCP处理下表现出相反的表达模式,这说明P450可能参与乙烯介导的果实成熟过程。克隆了3个果实特异表达的P450家族基因(comp164210、comp131532、comp152181),它们主要定位于细胞质和细胞膜中。本研究为苦蘵药用性状遗传改良提供了有价值的遗传信息。     

大豆蚜CYP4G51基因克隆及吡虫啉胁迫对其诱导效应

细胞色素P450是昆虫体内重要的解毒代谢酶,与昆虫对杀虫剂抗性有关。试验通过转录组测序获得1条新的大豆蚜细胞色素P450的cDNA序列,经国际P450命名委员会命名为CYP4G51,该基因GenBank登陆号为MG829857。cDNA序列全长2 347 bp,含1个长度为1 701 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,等电点约为6.46,分子质量约为64.5 ku。氨基酸序列中包含昆虫P450基因共有保守结构域。LC10、LC30和LC50不同浓度吡虫啉诱导3 h后,基因相对表达量均显著上调,与浓度呈正相关;LC50浓度下诱导12 h时相对表达量最高,为未诱导的5.467倍,表明该基因参与大豆蚜对吡虫啉的解毒代谢过程。     

小菜蛾细胞色素P450基因的cDNA片段克隆及其序列分析

以小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]3龄幼虫(对氰戊菊酯的LC50为38.75 mg/L)的总RNA为模板,利用简并引物,采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)方法扩增出1个长度为240 bp的cDNA片段。序列分析结果表明,扩增出的cDNA片段与细胞色素P450的Cyp6基因有较高的同源性。