重组鸡γ-干扰素联合鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫效果的研究

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ, ChIFN-γ)对鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)的免疫增强效果,取重组鸡γ-干扰素作为免疫增强剂,联合鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫SPF鸡,在免疫后24h和48h采集全血进行细胞因子检测,结果显示免疫后联合免疫组的IFN-γ和IL-4细胞因子水平要高于单独免疫疫苗组;免疫后7、14、21、28和35d分别采集血清测定抗体效价,通过检测血清中针对鸡新城疫病毒和禽流感病毒(H9亚型)的HI抗体水平可知,联合免疫组产生的针对鸡新城疫病毒和禽流感病毒(H9亚型)的抗体均高于单独免疫疫苗组。试验结果表明,重组鸡γ-干扰素对鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)具有免疫增强作用。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活 疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫程序研究

设计不同的免疫程序,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡,通过对ND、IB、H9抗体滴度监测,探讨ND、IB、H9抗体消长规律及鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)的免疫程序。试验结果表明,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡后,其诱导产生的ND、IB、H9抗体的消长规律基本同步;仅于10日龄免疫一次三联灭活苗,其抗体水平较低,于20、40日龄二免、三免或10日龄先用鸡新城疫病毒(La Sota株)、禽流感病毒(H9亚型,SS/94株)二联灭活疫苗作基础免疫,20或40日龄再用三联灭活苗作加强免疫,则上述3种抗体均快速上升,且维持时间长。根据试验结果,建议按照正常免疫程序作基础免疫的健康肉鸡,饲养期较短的可于20日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.3 mL/只;饲养期较长的则于40日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.5 mL/只。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)应用效果研究

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)(三联苗(Re-9株))为国内首个采用基因重组H9亚型禽流感疫苗株研制的新支流三联灭活疫苗。为研究疫苗上市后的实际应用效果,使用7日龄AA肉鸡和260日龄产蛋期蛋鸡评价三联苗(Re-9株)有效性。结果显示:肉鸡免疫后14 d即可激发抗体,免疫后21 d,新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)的血凝抑制(HI)抗体分别达8.6log2、6.2log2、8.3log2,出栏时仍维持在较高水平;于免疫后14 d抽样进行NDV、H9 AIV攻毒,对照组均100%发病或排毒,免疫鸡均可获得100%保护;在蛋鸡上,免疫三联苗(Re-9株)后28 d,NDV、IBV、H9 AIV的HI抗体效价分别达12.0log2、7.8log2、12.2log2,免疫后6个月仍可以维持在较高水平。结果表明:三联苗(Re-9株)在实际应用中免疫效果较好,本研究将为鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感的防控提供有力支撑。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒的拯救

对现地分离的4株H9亚型禽流感病毒HA基因进行序列测定,选取其中1株在新城疫病毒 La Sota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达H9亚型禽流感病毒野生型HA基因的重组新城疫病毒基因组cDNA克隆,经间接免疫荧光和RT-PCR鉴定,结果表明:拯救重组病毒为rL-H9HA;重组病毒MDT≥168 h,ICPI和IVPI均为0,与亲本疫苗株La Sota具有相似的生长特性;重组病毒保持了La Sota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性,具有作为同时预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景.     

H9亚型HP株禽流感病毒繁殖规律的探索

为了研究H9亚型HP株禽流感病毒接种非免疫鸡胚后病毒的繁殖规律,试验用H9亚型HP株禽流感病毒接种非免鸡胚,记录不同时间段死亡的鸡胚数量,并分别收获各时间段死亡鸡胚的尿囊液,测定不同时间段尿囊液的病毒效价。结果表明,接种H9亚型HP株禽流感病毒后,非免鸡胚死亡高峰期出现在60～84 h,死亡数量占接种鸡胚数的80%以上,而该时间段死亡鸡胚尿囊液的病毒滴度也处于最高峰,最高到达10^9.63EID₅₀/mL,直到96 h病毒仍维持较高水平(10^9.50EID₅₀/m L),而96 h后病毒滴度开始衰减。     

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La?Sota株+TJ株+HY株)经皮下和肌肉接种鸡的效力试验

以实验室试制的3批鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)经皮下和肌肉注射14和21日龄SPF鸡.免疫后21日,分别接种鸡新城疫、H9亚型禽流感和I群4型禽腺病毒强毒.结果表明,经肌肉和颈部皮下注射疫苗的14和21日龄鸡的攻毒保护率均为100%,攻毒对照组鸡100%死亡、发病或感染,健康对照组均100%健活或未感染.试验证明,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)经皮下及肌肉途径注射鸡均能起到良好的预防效果,因此,确定疫苗的注射途径为肌肉或颈部皮下.     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对禽流感H9亚型流行株攻毒的保护作用

为了监测鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(LaSota株+M41株+SS/94株)对H9亚型禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,采用H9亚型禽流感病毒SS/94株及2009—2010年现地分离的3株H9亚型禽流感病毒对已免疫上述三联灭活苗的SPF鸡进行攻毒试验。结果显示,试验鸡以0.3 mL/只的剂量免疫三联灭活苗后21 d,其H9亚型禽流感病毒的HI抗体效价可达8～11log2,此抗体水平可抵抗2×106EID50的H9亚型禽流感病毒SS/94株、BLCN09株、WDZ09株、YT10株的攻击,攻毒保护率均达90%(9/10)以上。可见,以SS/94株作为禽流感疫苗抗原制备的三联灭活苗具有良好的免疫原性,能使免疫鸡抵抗2009—2010年期间现地分离的多株H9亚型禽流感病毒的攻击。     

鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验

用NDV分离株及La Sota株为抗源液，经福尔马林灭活后，与油佐剂混合，分别制成分离株灭活苗、La Sota株灭活苗及分离株与La Sota株二价灭活苗。将这三种灭活疫苗分别免疫SPF鸡后，均获得100%抵抗NDV分离株及F48株强毒攻击的保护力；而用这3种灭活苗与La Sota活苗单独或联合使用，免疫带有ND母源抗体的普通鸡后，3种灭活苗的免疫效力不同，分离株灭活苗与价灭活苗对NDV分离株攻击的免疫保护效力明显优于La Sota灭活苗；灭活苗与活苗同时使用，其免疫效力明显优于单独使用灭活苗或活苗。     

鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的研究

为研制鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI,H9亚型)三联灭活疫苗,用新城疫病毒(NDV)La Sota株及H9亚型禽流感病毒(AIV)WD株分别接种易感鸡胚培养,用传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJQ902株接种DF-1细胞培养,收获病毒液,经超滤浓缩、甲醛灭活后,加入油佐剂乳化制成3批疫苗。对3批制品进行了检验,其性状检验、装量检查、无菌检验、甲醛、汞类防腐剂残留量测定均符合要求,鸡对疫苗无任何不良反应。效力检验结果显示:ND部分以20μL/只剂量免疫,血凝抑制(HI)效价达5.6~6.1 log_2,攻毒后均能提供100%保护;IBD部分以0.5 mL/只剂量免疫,中和抗体效价达16.0~16.4 log_2,攻毒后均能提供100%保护;AI(H9亚型)部分以0.3 mL/只剂量免疫,HI效价达8.7~9.0 log_2,攻毒后均能提供100%保护。试验结果证实,研制的疫苗安全、免疫效力高。     

鸡群加强免疫新城疫活疫苗(CS2株)与灭活苗(La Sota株)的效果对比

为了比较新城疫活疫苗(CS₂株)与灭活苗(La Sota株)对鸡群的加强免疫效果,本试验对首次已饮水免疫过新城疫弱毒苗的鸡群,再次用新城疫活疫苗(CS₂株)与灭活苗(La Sota株)分别进行加强免疫,采用血凝抑制试验方法检测新城疫免疫抗体,并作对比分析。结果显示：加强免疫使用灭活苗(La Sota株)比用活疫苗(CS₂株)的免疫合格率更高,免疫效果更理想。     

不同禽流感病毒含量的新-流二联灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体水平的监测

将未浓缩的新城疫抗原分别与未浓缩的、浓缩3倍、浓缩6倍的禽流感抗原混合,并制备成三组鸡新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗（简称新-流二联灭活疫苗）,分别免疫21日龄SPF鸡,每羽0.3 mL,同时设置未免疫的空白对照组,免疫组与对照组均在免疫前及免疫后7、14、21、28、35 d进行采血,检测新城疫和禽流感抗体。结果发现,各免疫组在免后不同日龄的新城疫抗体基本一致,禽流感病毒抗原浓缩倍数越高（即禽流感病毒含量越高）的新-流二联灭活疫苗,免后14、21 d的抗体也越高;从免后21 d开始,各免疫组的禽流感抗体水平差异逐渐减小,免疫后禽流感抗体水平的高低可以反映该疫苗的免疫效果。试验结果表明,该疫苗可以通过浓缩提高抗原病毒含量的方法来提高免后早期抗体水平,取得良好的早期免疫效果。     

2019年秋季双鸭山市禽流感和鸡新城疫集中抗体监测与分析

通过血凝和血凝抑制试验方法,对双鸭山市内各区秋季集中免疫禽流感和新城疫的鸡群进行免疫监测,结果显示,禽流感H5亚型抗体监测群体合格率为94.3%,禽流感H7亚型抗体监测群体合格率为95.2%,鸡新城疫抗体监测群体合格率为90.4%。参照农业部相关规定,灭活疫苗家禽免疫21 d后监测群体合格率要求≥70%,结果表明,秋季集中免疫禽流感和鸡新城疫抗体水平较高,具有很好的保护力。     

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量（EID₅₀）为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间（MDT）为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。     

Isolation,Identification and Immunogenicity Evaluation of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus HF Strain

In 2015,an H9N2 subtype avian influenza virus (AIV) strain was isolated from a chicken farm in Hefei,Anhui,and named HF strain.The results of the chicken embryo proliferation characteristics study showed that the half infection rate of chicken embryo (EID₅₀) was 10^9.17/0.1 mL,and the mean time to death for minimum lethal dose(MDT) was 87 h.The analysis result of HA gene showed that its amino acid cleavage site was located in RSSR↓GLF,which accorded with the characteristics of low pathogenic avian influenza.The genetic evolution analysis of HA gene revealed that the isolate belonged to the h9.4.2.5 lineage,which accorded with the current virus strain epidemic characteristics.The HF strain was prepared with 10 H9N2 subtype AIV isolates which isolated from all over the country from 2006 to 2018 to prepare inactivated vaccines,immunize SPF chickens,prepare positive sera,and analyze the virus antigenicity by cross hemagglutination inhibition test.The results showed that the correlation between the HF strain and the virus antigens before 2014 and was between 0.50-0.56,and the virus antigen correlation after 2014 was 0.89-1.00.This showed that the isolate had good antigenic correlation with epidemic strains in recent years.Inactivate HF strain virus solution with 0.2% formaldehydel,and its HA titer did not change before and after inactivation.After the inactivated virus solution was prepared into an oil emulsion inactivated vaccine to immunize SPF chickens,21 days after immunization,the average value of the HI antibody titer reached 9.0log2.It could make immune chicken completely resistant to H9 subtype AIV infection and provide 100% protection from challenge.The above research results showed that the HF strain had good immunogenicity and could be used as a vaccine candidate strain for the prevention of H9N2 subtype AIV.     

一种免疫增强剂对新-流二联灭活苗抗体消长规律的影响

免疫增强剂是一种能增加疫苗免疫效果的生物活性物质。试验A组为添加了免疫增强剂的新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株),试验B组为未添加免疫增强剂的新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株),分别比较A组与B组的抗体水平。试验结果表明:7日龄SPF鸡A组抗体与B组抗体无差异;在28日龄SPF鸡上:免后10、15、21、28、35 d,ND部分A组抗体比B组分别高0.2log2、0.6log2、1.5log2、0.9log2、0.5log2,AI部分抗体高出0.1log2、0.3log2、1.2log2、1.0log2、0.6log2;在7日龄商品蛋鸡上A组抗体比B组抗体在免后15、21、28、35 d,ND部分抗体高出1.6log2、2.0log2、1.9log2、3.7log2,AI部分分别高1.3log2、2.7log2、1.8log2、2.0log2。     

Dot-ELISA检测H9亚型禽流感病毒的研究

本研究采用兔抗H9亚型禽流感病毒（AIV）IgG包被于硝酸纤维素膜,酶标羊抗兔IgG作二抗,建立检测H9亚型AIV的Dot-ELISA法。经方阵试验确定兔抗AIV IgG工作浓度为1∶400,酶标羊抗兔IgG的工作浓度为1∶400。作者建立的Dot-ELISA对AIV的最小检测量为3.35×10-9g。Dot-ELISA与HA和HI、AGP及病毒分离法相比,检测63份临床疑似H9亚型AIV病料,Dot-ELISA检出32份(57.14%),HA和HI检出15份(23.81%),AGP检出11份(17.46%),病毒分离检出38份(60.30%)。用抗H9亚型AIV阳性血清可以阻断Dot-ELISA阳性反应,诊断膜片与鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒不出现阳性反应,证明Dot-ELISA特异性好。分别置室温(25 ℃左右)、4 ℃和-20 ℃下保存1个月后,膜片诊断效果不变,对照反应均成立,该方法重复性好（重复符合率为93.9%）,操作简便（3 h内可完成）,不需要特殊检测仪器,结果客观,肉眼易于判断,是微生物和传染病及寄生虫病诊断标准化的新技术之一。     

Protective efficacy of commercial Newcastle disease vaccines against challenge of goose origin virulent Newcastle disease virus in geese

Since 1997, severe outbreaks of Newcastle disease (ND) in geese in many regions throughout China have resulted in high morbidity and mortality, and great economic loss to farmers; however, no licensed, specific vaccine is yet available for this disease in China. In this study, goslings were immunized with different combinations and dosages of several commercial ND vaccines including La Sota vaccine, Mukteswar vaccine, recombinant live vaccine against avian influenza (AI) and ND (rL-H5 strain), and inactivated ND oil-emulsion vaccine (La Sota strain). The protective effects were evaluated based upon the level of antibody response and the degree of protection against the goose-origin virulent NDV strain. The result showed that two doses (i.e., one more than that for chicken) of La Sota vaccine priming, followed by 2-5 doses of Mukteswar vaccine boosting 2-3 weeks later, not only induced higher HI antibody levels, but also conferred longer-lasting protection. This immunization procedure can be recommended for prevention of ND in geese.