小麦生理型雄性不育花药绒毡层和孢粉素变化与RAFTIN1表达的关系

 【目的】研究小麦生理型雄性不育花药绒毡层变化、孢粉素累积与RAFTIN1表达间的关系,为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。【方法】以杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系、质核互作遗传型雄性不育系,正常可育近等基因系为试材,通过石蜡切片、细胞荧光染色和荧光定量PCR技术,研究小孢子不同发育时期花药绒毡层的形态变化、孢粉素的累积及RAFTIN1的表达。【结果】单核期生理型不育系花药绒毡层提前降解,分泌孢粉素的含量降低,RAFTIN1提前高表达,使大量孢粉素转运至花粉壁层;二核期和三核期,生理型不育系绒毡层完全退化,停止分泌孢粉素,RAFTIN1呈现明显的下调表达模式。【结论】杀雄剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理与绒毡层的提前降解和定向转运孢粉素的RAFTIN1表达高低直接相关。     

利用基因工程创造植物雄性不育的策略

利用基因工程创造植物雄性不育系是近年来发展的新技术。根据花粉败育的原理,利用花药细胞绒毡层、绒毡层线粒体、胼胝质壁、细胞减数分裂过程等花粉形成过程中的不同环节,采取外源细胞毒素基因、分子伴侣、反义RNA技术、提早降解胼胝质、扰乱线粒体与细胞核之间的信息交流和细菌影响花粉小孢子发育等策略,使花粉不能正常形成,从而产生不育花粉,达到产生雄性不育的目的。并提出了基因工程创造植物雄性不育系可能存在的问题及其应用前景。     

甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系的选育及其细胞学研究

【目的】利用甘蓝型油菜隐性上位互作细胞核雄性不育材料的杂种优势,阐明其雄性不育的机理。【方法】以引进的油菜杂交种"皖油14"为材料,采用自交、姊妹交、测交的方法,对其后代进行选育;通过石蜡切片法,对选育得到的纯合两型系中的可育株1740B、不育株1740A及全不育系1740CA植株的雄蕊发育特点进行细胞学观察。【结果】选育得到甘蓝型油菜隐性上位互作细胞核雄性不育材料的临保系1740C和纯合两型系1740AB。细胞学观察结果表明,可育株1740B的雄蕊发育正常,可形成成熟的花粉粒,花药发育过程主要包括孢原细胞时期、造孢细胞时期、花粉母细胞期、减数分裂期、单核花粉期、二核花粉期和三核花粉期;纯合不育株1740A的雄蕊败育发生在四分体后期,由于四分体周围的胼胝质不能解体和绒毡层细胞的径向肥大,使得四分体被挤向药室中央且原生质体浓厚,然后逐渐解体死亡,最后整个花粉囊萎缩变形;全不育系1740CA的花粉败育过程从小孢子时期到二核期均有发生,花粉细胞外只能形成极薄的一层花粉壁,绒毡层脱落并径向肥大,将花粉细胞挤向药室中央,花粉细胞质逐渐降解,细胞变形,最终变成一个无内容物的空壳。【结论】利用"临保系"进行测交选育是从定性的角度来辨别遗传分离比例的差异;甘蓝型油菜隐性上位互作细胞核雄性不育材料中,纯合不育株与杂合不育株的雄蕊败育时期及特征存在差异。     

甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A 花药发育的细胞学研究

【目的】明确甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A花药败育的时期及细胞学特征,为进一步研究其雄性不育的机理奠定理论基础。【方法】用不同温度（16℃和22℃）处理试验材料不育系TE5A,分别观察植株的育性及花器形态;并采用常规半薄切片技术,通过甲苯胺蓝、苯胺蓝和苏丹黑B等染料进行染色,观察并比较该不育系TE5A不育植株和可育植株花药发育的显微结构、胼胝质以及脂质体等脂类物质的异同;进一步通过透射电镜对其花药发育的超微结构进行比较观察。【结果】当把可育株油菜从16℃光照培养箱移到22℃光照培养箱后7 d,观察到花朵的育性转变为雄性不育。把22℃光照培养箱的不育株油菜移到16℃光照培养箱后,观察到先开放的花朵表现为雄性不育,而随后开放的花朵表现为雄性可育。在不育环境下的不育株TE5A花朵的花瓣大小和形态与可育株花朵没有明显差异,但不育株花朵的花丝显著短于可育株的花丝,并且花药萎缩、干瘪,没有花粉粒附着在上面。在不育环境下,不育系TE5A花药败育发生在花粉母细胞减数分裂时期,花粉母细胞减数分裂发生异常,没有二分体及四分体的形成,形成“拟小孢子”。胼胝质在花粉母细胞时期可以正常合成,但后续的降解滞后,在四分体时期没有降解,直至花粉粒成熟期才开始降解。绒毡层没有观察到明显异常,并能分泌脂质体等脂类物质。“拟小孢子”的花粉粒外壁发育异常,无法形成具有特殊柱状体和顶盖结构的花粉粒外壁,因此,不能结合孢粉素和脂质体等物质。随着花药的继续发育,最后“拟小孢子”逐渐降解,只剩下花粉空壳。【结论】甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A花朵的花瓣大小和形态与可育株花朵没有明显差异,但花丝显著缩短,花药萎缩、干瘪,没有花粉粒附着在上面。不育系TE5A花药败育发生在花粉母细胞减数分裂时期,减数分裂异常导致无法形成二分体及四分体,并且胼胝质的异常降解及花粉粒外壁的异常对花药败育也有重要影响。甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A可以作为一新型甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系材料。     

石竹雄性不育系小孢子形成过程的细胞学观察

 【目的】研究石竹不育系与可育系小孢子形成过程的异同。【方法】利用压片及石蜡切片等方法观察石竹雄性不育系与可育系小孢子发育过程。该不育系（H-37B）是通过在石竹自交6代的自交系中发现的1株雄性不育株与可育株经过连续杂交和2代回交获得的不育系（H-37B）。【结果】可育系小孢子发育经历了造孢细胞、小孢子母细胞、四分体等时期,最后发育成花粉。不育系败育现象在造孢细胞增殖期、小孢子母细胞减数分裂期以及四分体至单核期都有发生。石竹可育花粉外形饱满,圆形,生活力强;而不育花粉外形空瘪,不规则,无生活力。【结论】绒毡层的异常发育是导致小孢子败育的主要原因。     

韭菜雄性不育系及保持系花药和花粉发育的细胞学比较

为了从细胞学角度研究韭菜雄性不育的机理,本试验利用石蜡切片法对韭菜雄性不育系及其对应保持系花药与花粉发育过程进行了比较研究。结果表明:韭菜花药绒毡层兼有分泌绒毡层与变形绒毡层的特点,花粉败育与绒毡层发育异常和提前解体有关。韭菜败育分两种类型:败育Ⅰ型,败育发生在减数分裂二分体至四分体时期,不育系绒毡层细胞液泡化膨大,花粉母细胞减数分裂不正常,不产生四分体或产生无胼胝质壁包裹的异常四分体,最终粘连连成一团解体消失;败育Ⅱ型,败育发生在单核小孢子时期,绒毡层在四分体时期提前退化,单核小孢子无营养供应而败育。     

花椰菜温敏雄性不育系GS-19花药败育的细胞学及转录组分析

【目的】对花椰菜温敏雄性不育系的花器形态、花药败育时期和败育分子机理进行研究,明确其不育特性发生的细胞学和分子机理,为进一步研究其雄性不育奠定理论基础。【方法】以花椰菜温敏雄性不育系GS-19为试验材料,不同温度(15℃和20℃)处理,采用形态学、细胞学方法及高通量测序技术(Illumina Hi Seq 2500),研究其形态特征、花药败育的细胞学及分子机理。【结果】花椰菜温敏雄性不育系GS-19的育性转换受温度控制,高温(20℃)不育,低温(15℃)育性恢复。GS-19不育株与可育株花器差异显著,不育株花器显著小于可育株。花药细胞学观察发现GS-19的花药发育过程有花粉母细胞的分化,形成正常花粉囊,不产生花粉粒或者产生微量的无生活力的花粉粒,花药发育受阻于花粉母细胞到四分体时期,形成了花粉粒外壁发育异常的拟"四分体孢子",逐渐降解,剩下花粉空壳,属于花粉母细胞败育类型。GS-19不育株和可育株花蕾转录组分析共获得67 930个Unigene,其中Nt数据库比对到相似序列数最多(52 191个),Nr数据库比对到相似序列次之(46 447个),KOG数据库比对相似序列最少(13 198个);GO注释到25 336个Unigene;KOG注释到13 198个Unigene;KEGG注释到14 778个Unigene。基因差异表达分析发现GS-19不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170个基因差异表达,1 078个基因上调表达和1 092个基因下调表达。【结论】花椰菜温敏雄性不育系GS-19为高温不育类型,不育株花器显著小于可育株,花丝显著缩短,花药萎缩、干瘪,花药发育受阻于花粉母细胞到四分体时期,属于花粉母细胞败育类型。转录组测序获得了67 930个Unigene,差异表达基因2 170个。     

白菜细胞核雄性不育两用系的性状比较分析

用比较分析的方法，对白菜核雄性不育两用系中不育株与可育株的植株性状、育性、花器结构和花粉扫描电镜形态等进行观察研究，结果表明：白菜核雄性不育两用系中不育株花粉败育彻底，不育株与可育株呈1：1分离，是一种稳定可靠的核雄性不育两用系；对不育株与可育株花蕾总蛋白进行了SDS-PAGE凝胶电泳，发现不育株与可育株都有各自的一条特异蛋白条带，分别命名为A-1和B-1，两者的表达量都比较高。     

细胞骨架与小麦雄性不育关系研究初报

以T型细胞质雄性不育(CMS)、化学杂交剂(CHA)诱导的雄性不育及成熟可育的花粉粒为材料, 用考马斯亮蓝R250显示细胞内微丝的方法,观察分析了3种类型花粉粒内微丝结构的变化。结果表明,成熟可育 花粉粒内微丝多以多聚体的形式存在,呈连续排列的网状结构且充满整个花粉粒;而其他两种不育花粉粒内,连续 排列的网状结构被破坏而呈颗粒状或短棒状结构,收缩集中分布于花粉粒中部,花粉粒周缘缺乏,且T型细胞质雄 性不育系的内微丝含量较化学杂交剂诱导的雄性不育花粉粒的少。     

基因差异表达导致油菜温敏雄性不育系的育性转换（英文）

[目的]获得与油菜温敏雄性不育系K121S育性转换相关的功能基因。[方法]以油菜温敏雄性不育系K121S为材料,分别取可育温度下和不育温度下的花粉母细胞期、四分体期、三核期和成熟期的花蕾提取RNA,利用DDRT-PCR方法进行基因表达差异显示,共获得了44条差异表达的c DNA片段。[结果]经测序和BLAST序列比对分析,筛选出7个候选基因的差异表达与K121S的育性转换有关,推测胼胝质合成酶基因、乙醛脱氢酶基因、RNA聚合酶Ⅰ转录因子RRN3基因在转录水平差异表达,而H+-ATP酶基因、I类果糖二磷酸醛缩酶基因、富含亮氨酸重复的丝氨酸/苏氨酸类受体激酶基因、碱性/中性转化酶基因在转录后水平RNA剪接时差异表达。[结论]该研究结果对揭示油菜温敏雄性不育的分子机理提供了依据。     

化学杀雄剂SQ-1和阿拉伯葡聚糖蛋白对小麦品种间杂交及远缘杂交成胚率的影响

【目的】探究化学杀雄剂SQ-1对小麦品种间、小麦与近缘植物间、小麦与远缘植物间杂交成胚率的影响,以及阿拉伯葡聚糖蛋白对小麦与玉米杂交成胚率和得苗率的影响。研究结果对于合理选用小麦杂交方式,提高小麦杂交结实率和利用玉米诱导小麦单倍体植株的效率具有重要意义。【方法】通过在小麦拔节期喷施化学杀雄剂SQ-1,开花期分别授以小麦花粉和远缘植物(黑麦、玉米)花粉,并在小麦授玉米花粉后的处理液中加入不同浓度的阿拉伯葡聚糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGP),对小麦与玉米杂交后产生的幼胚进行离体拯救培养,统计授粉小花数、接种幼胚数、膨大颖果数、结实粒数、萌发单倍体幼胚数和单倍体植株数,计算结实率、颖果膨大率、成胚率、萌发率和成苗率并对所得数据进行差异显著性分析,结合细胞学观察结果,研究SQ-1对小麦品种间杂交及远缘杂交结实性的影响,以及AGP对小麦单倍体胚诱导率的影响。【结果】在不同小麦品种间杂交中SQ-1处理结实率19.8%—83.3%,人工去雄的结实率为69.4%—93.0%,SQ-1对不同品种的影响不同,Fielder对SQ-1的反应比较敏感;在中国春与兰州黑麦杂交中,SQ-1处理的结实率为65.5%,人工去雄处理的结实率为78.8%,两种处理方式产生的F1杂种的染色体数均为28条;在不同小麦品种与玉米品种郑单58杂交中,SQ-1处理小麦单倍体胚的成胚率为1.11%—1.41%,人工去雄小麦单倍体胚的成胚率为2.38%—14.29%;在小麦与玉米杂交后的处理液中添加0.5—2.0 g·L-1 AGP一定程度地提高了小麦单倍体胚获得率和成苗率。另外,在玉米花粉诱导的单倍体胚离体培养过程中,发现13.07%的胚发育出了2—6株苗;显微镜观察发现,玉米花粉诱导后18 d左右小麦单倍体胚上出现了多个突起,这些突起在离体培养条件下进一步发育为形态健全的小植株,其染色体数目均为21条。【结论】化学杀雄剂SQ-1减低了小麦品种间杂交及小麦与黑麦、玉米间杂交的成胚率,AGP提高了小麦与玉米间杂交单倍体成胚率和成苗率。     

哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系差异表达基因分析

 【目的】通过筛选哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系间败育关键时期花药中差异表达的基因,为进一步揭示棉花雄性不育机理,更好地利用棉花细胞质雄性不育材料奠定基础。【方法】以哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系间败育关键时期,即花粉母细胞时期之前的花药为研究材料,应用cDNA-AFLP技术分离和鉴定两材料间差异表达的片段,并对差异片段进行验证、克隆、测序和生物信息学分析。【结果】共得到108个差异表达片段,其中67个被成功克隆,通过BLAST分析发现,29个片段可以在NCBI数据库中找到同源序列,对这些序列进行Gene Ontology分析后得知这些片段主要参与信号转导、转录、能量代谢、细胞壁发育等相关过程。其中,在两材料间还分离到一些与RNA编辑和雄配子发育相关的基因存在差异表达,而这些可能与棉花细胞质雄性不育相关。【结论】本研究通过cDNA-AFLP的分析,在棉花细胞质雄性不育系和保持系间分离到了108个差异表达的片段,通过对这些片段的分析,对两材料间差异表达的基因信息有了一个基本了解,这些结果为更好地了解棉花细胞质雄性不育发生过程相关基因的调控网络,揭示棉花雄性不育机理打下基础。     

化学杂交剂SQ-1诱导江汉平原小麦雄性不育的初步研究

在江汉平原麦区,以时期为主区、剂量为副区、小麦品种为副副区再裂区的田间设计方法,对化学杂交剂SQ-1诱导小麦雄性不育的效果进行了研究。结果表明:(1)SQ-1具有较宽的活性窗口,适宜喷施时期为Feeks8.0-9.0;(2)以3.0kg/hm2和5.0kg/hm2的SQ-1剂量对供试的3个基因型小麦材料均能诱导95%以上的相对雄性不育率;(3)SQ-1可降低小麦雌蕊育性,对小麦株高、抽穗等其他农艺性状无明显影响。     

一个玉米细胞质雄性不育系的鉴定及遗传分析

【目的】阐明新育成的雄性不育系农系928cms-Q1261的胞质类型、败育时期和遗传机制,为其育种应用提供依据。【方法】将不育系在不同年份、不同地点种植,鉴定育性表现,通过测交、姊妹交、反交对不育性的遗传进行分析,利用特异引物进行PCR扩增鉴定胞质类型,通过石蜡切片法在光学显微镜下观察小孢子发育过程。【结果】农系928cms-Q1261雄穗无花药外露,花粉败育彻底,不育性表现稳定;质不育基因来自自交系Q1261,为S型;核不育基因来自农系928,由1对隐性基因控制;小孢子从单核晚期开始自溶,成熟期完全降解;自交系郑58能保持其不育性。【结论】农系928cms-Q1261属于S型不育胞质,是一种无花粉型的细胞质雄性不育系,其恢复系广泛。     

D~2型细胞质雄性不育小麦绒毡层细胞程序化死亡与活性氧代谢

【目的】D2型细胞质是细胞质雄性不育小麦(cytoplasmic male sterility,CMS)的重要胞质来源,深入研究其败育机理对小麦杂种优势利用具有重要价值。【方法】以3种同核异质D2型细胞质雄性不育小麦Va87B1-706A、C687B1-706A、Ju87B1-706A及其相应保持系706B为试材,通过体式显微镜和DAPI染色分别在四分体时期、单核早期、单核晚期、二核期和三核期观察小麦花药的外形和小孢子发育的形态;利用扫描电镜和KI-I2染色分析三核期花药外皮层、内皮层、乌氏体和花粉粒的表型及败育特点;采用石蜡切片和DNA ladder的技术观察不同发育时期D2型不育系和保持系小麦花药绒毡层细胞形态变化特征以及绒毡层细胞程序化死亡(programmed cell death,PCD)的过程;测定花药发育过程中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase,CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的活性以及非酶物质还原型抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量变化;同时利用RT-PCR技术对部分抗氧化酶相关基因的表达模式进行分析。【结果】与保持系706B比较,3种D2型细胞质雄性不育小麦在三核期均表现出外皮层表皮褶皱、乌氏体排列稀疏散乱以及小孢子皱缩、表皮粗糙和萌发孔闭合的不育特征,败育类型为典败和染败;自单核晚期开始3种不育小麦的小孢子发生紊乱;石蜡切片观察绒毡层细胞的变化,发现不育系均比保持系延迟一个时期在二核期发生解体,并于三核期完全降解;进一步检测细胞凋亡DNA小片段发现3种不育系花药绒毡层的DNA损伤均起始于单核晚期,绒毡层PCD比保持系延迟一个时期启动,并且优先细胞学表型检测到凋亡;生理指标测定和定量分析的结果说明绒毡层细胞的延迟凋亡和小孢子的结构异常与不育系花药内活性氧的过度积累、抗氧化酶活性的异常变化、非酶促抗氧化物质的严重下调以及部分抗氧化酶相关基因在两系花药中表达水平的严重差异密切相关。【结论】D2型细胞质雄性不育小麦败育的关键时期是单核晚期,绒毡层PCD的延迟启动诱导了活性氧的过量积累,进一步破坏了抗氧化防御系统的平衡,进而造成绒毡层细胞形态异常,最终导致D2型细胞质雄性不育小麦的败育。     

作物细胞质雄性不育与肌动蛋白

本文比较了小麦、玉米及白莱的细胞质雄性不育系与保持系花药或花粉中的肌动蛋白。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,保持系含有明显的肌动蛋白区带;而雄性不育系的区带不明显。将凝胶进行光密度扫描亦表明,保持系比不育系所含肌动蛋白数量多。并比较了花药或花粉中的肌动蛋白与兔骨骼肌的肌动蛋白,其电泳迁移率完全相同。     

小麦TaTDR-Like基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦绒毡层退化基因（Tapetum degeneration retardation,TaTDR-Like）,研究其组织表达及不同育性材料间花药不同发育时期的时空表达模式,为深入揭示小麦花药异常发育的分子机制打下理论基础。【方法】以普通小麦品种西农1376（MF-XN1376）为材料,通过PCR扩增克隆得到TaTDR-Like基因的3个同源拷贝,利用生物信息学分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因启动子顺式作用元件,利用实时荧光定量PCR检测TaTDR-Like基因的组织表达情况及在可育、不育材料花药不同时期中的时空表达模式,利用酵母双杂交技术进行自激活检测,并构建植物融合表达载体35S-TaTDRLD-EGFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察TaTDRL-D蛋白亚细胞定位情况。【结果】成功克隆小麦TaTDR-Like基因,发现该基因存在3个同源拷贝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D,分别编码550、553、557个氨基酸,其蛋白分子量分别为58.50、58.90和59.21 kD,等电点（pI）分别为4.77、4.66和4.63。TaTDR-Like蛋白均在C端有1个bHLH保守结构域,其中TaTDRL-A与TaTDRL-B的保守结构域相似度达100%,与TaTDRL-D的保守结构域相似度为96%,TaTDRL-D与OsTDR、AtAMS保守结构域相似度分别为98%和88%;系统发育进化树表明TaTDR-Like蛋白与大麦（KAE8787147.1）、二穗短柄草TDR（XP_014756384）、水稻TDR（Os02g0120500）和拟南芥AMS（AT2G16910.1）的进化关系较密切;启动子分析表明TaTDR-Like基因启动子处含有较多光响应元件、非生物应激反应、激素响应元件等顺式作用元件;组织特异性表达分析显示TaTDRL-D在花药中的表达量最高,而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表达量较高;对花药发育不同时期表达分析显示TaTDRL-D在花药发育单核早期表达量最高,之后逐渐降低,单核晚期到三核期不育材料（CMS-XN1376）表达量均高于可育材料（MF-XN1376）;自激活检测结果表明TaTDRL-D具有转录激活活性;亚细胞定位显示TaTDRL-D蛋白定位于细胞核。【结论】TaTDRL-D基因可能参与小麦花药发育,负调控花药育性。