反义4CL1基因转化烟草调控木质素生物合成

将控制木质素生物合成的关键限速酶 (香豆酸CoA连接酶 ,4CL)基因 4CL1反向插入植物表达载体pBI12 1构建表达载体 ,通过农杆菌叶盘法介导转化烟草 ,获得一批转基因抗性植株 .经PCR检测 ,证明 4CL1基因已成功反义转入到烟草植株中 .通过对转基因植株和对照植株的纤维素和木质素含量的对比分析 ,发现反义 4CL1基因转化植株的纤维素含量比对照提高了 11 4 % ,而木质素含量比对照降低了 19 1% .     

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .     

重组毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶的酶学性质研究

4-香豆酸: 辅酶A连接酶（4CL）催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明:Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0～8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg2+是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物.      

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80 ℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。      

水稻4CL基因启动子引导的GUS在紫外诱导下的组织特异性表达

 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是位于苯丙烷类共同代谢途径中类黄酮、木质素以及肉桂酸酯等分支代谢途径交叉点上的关键酶，对整个代谢过程起着重要的调控作用。4CL基因的表达可被真菌侵染，紫外辐射，机械损伤等外界刺激所诱导。笔者将水稻R4CL-1基因启动子与GUS基因融合导入烟草基因组中，并在紫外诱导下对转基因植株进行了β-Glucuronidase活性的组织化学染色分析。在转基因烟草植株幼叶的叶脉及其周围细胞、幼根的根尖细胞及维管组织、成熟花的花瓣及柱头、未成熟种子的表皮细胞和成熟种子的胚中都检测到了GUS活性，而在完全伸展的老叶、茎（幼茎和成熟茎）、老根和花的其它组织中均没有观察到GUS酶活性，从而证明了R4CL-1启动子能在植物发育过程中指导GUS报告基因的组织特异性表达。     

桃内果皮木质素沉积过程中酶活性的变化

以大久保和京玉两个桃品种为试材,对果实发育过程中桃内果皮的木质素含量及其相关酶活性进行了测定。结果表明：在盛花后28d时两品种的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）和肉桂醇脱氢酶（CAD）的活性都达到最大值,随后都呈现出总体下降的趋势;过氧化物酶（POD）的活性则在盛花后21d时就达到最大值,随后也呈现出总体降低的趋势;而在整个果实发育过程中,两品种桃内果皮中木质素的含量却逐渐增加。由此推论,当PAL,C4H,4CL,CAD和POD表达到一个相对高的水平,形成足够合成木质素所需的前体物质时,桃内果皮才开始快速积累木质素。     

桃内果木质素沉积过程中酶活性的变化

以大久保和京玉两个桃品种为试材,对果实发育过程中桃内果皮的木质素含量及其相关酶活性进行了测定。结果表明：在盛花后28d时两品种的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）和肉桂醇脱氢酶（CAD）的活性都达到最大值,随后都呈现出总体下降的趋势;过氧化物酶（POD）的活性则在盛花后21d时就达到最大值,随后也呈现出总体降低的趋势;而在整个果实发育过程中,两品种桃内果皮中木质素的含量却逐渐增加。由此推论,当PAL,C4H,4CL,CAD和POD表达到一个相对高的水平,形成足够合成木质素所需的前体物质时,桃内果皮才开始快速积累木质素。     

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶338Val缺失突变分析

通过对毛白杨中的4--香豆酸:辅酶A连接酶1（Pt4CL1）蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸催化活性的Pt4CL1蛋白突变体338dVal。与野生型4CL1蛋白活性相比较,该突变体获得了催化芥子酸的活性,比活力是(162±034) nkat/mg。同时,对4--香豆酸催化活性有轻微的降低（约降低12％）,对咖啡酸的催化活性有明显增加（约增加126％）,对阿魏酸的催化活性有部分的降低（约降低29％）,对肉桂酸的催化活性没有显著变化。该结论证实了第338位缬氨酸对底物芥子酸5位甲氧基具有空间位阻效应。该项研究为通过基因工程技术调控木质素的合成提供了新的方法。      

Effects of UV-B treatment on controlling lignification and quality of bamboo (Phyllostachys prominens) shoots without sheaths during cold storage

For evaluating the effects of UV-B treatment on lignification and quality of bamboo(Phyllostachys prominens) shoots during postharvest, fresh bamboo shoots without sheaths were irradiated with UV-B at a dose of 8.0 kJ m~(–2) and then stored at(6±1)℃ along with 85–90% relative humidity(RH) for 15 d. The results showed that UV-B treatment apparently slowed down the increase rates of flesh firmness, weight loss, and contents of cellulose and lignin. It also decreased the activities of 4-coumarate CoA ligase(4CL), peroxidase(POD), cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD) and phenylalanine ammonialyase(PAL) and the expression of their encoding genes during cold storage. It was suggested that these effects of UV-B treatment on decreases in these enzymatic activities and the expression of encoding genes might collectively regulate lignin synthesis and accumulation in the flesh of bamboo shoots and consequently benefit in maintaining the edible quality of bamboo shoots during cold storage.     

Analysis of the Lignin Contents and Related Enzymes Activities in Seed Coat Between Black-Seeded and Yellow-Seeded Rapes (Brassica napus L.)

One pair of near isonegic yellow/black seeded rape (Brassica napus L) were used as experimental materials to study the changes of lignin contents and enzymes activities of 4-coumarate: CoA ligase (4CL), Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) and ferulate 5-hydroxylase (F5H) in seedcoats during the stage of seed development. The variation analysis showed that the changes of lignin contents and enzyme activities of 4CL, CAD and F5H in seed coat had significant differences between black- and yellow-seeded rapes, and also between different development stages. The correlation analysis demonstrated that the lignin contents were positively correlative to the activities of all three enzymes investigated in the study, and the interactions between them in the seed coat of the two lines. For yellow-seeded rape, the correlation coefficient (0.7262018) of lignin content and the interaction between 4CL and F5H was significant, the lignin contents were highly positively correlative to the activities of CAD and F5H, the interaction between 4CL and CAD, and the interaction between CAD and F5H. For the black-seeded rape, only the lignin content was highly positively correlative to the activity of F5H (the correlation coefficient was 0.772949), the other correlation coefficients, i. e. lignin contents to 4CL, CAD activities, the interactions between the three enzymes were not significant although all the correlation coefficients were above 0.5000. The results suggested that 4CL, CAD and F5H regulated the biosynthesis of lignin in seedcoat of rapes,leading to the lignin contents in the seedcoats of the yellow-seeded rape much lower than that of the black-seeded line,and affecting the thickness of the developing seedcoats in rapes. Therefore, it was likely to change the seedcoat ratio by overexpressing or suppressing the activities of one of the enzymes, both of them or all of them.     

水杨酸对厚皮甜瓜采后病害及苯丙烷代谢的影响

【目的】探讨采后水杨酸处理对厚皮甜瓜果实采后病害的抑制效果和苯丙烷代谢的增强作用。【方法】以‘玉金香’厚皮甜瓜为试材,用4 mmol•L-1水杨酸采后常温浸泡10 min,测定处理对粉红单端孢（Trichothecium roseum）损伤接种果实病斑直径和自然发病率的抑制,以及对果实苯丙烷代谢关键酶活性和产物积累的影响。【结果】水杨酸处理不仅明显降低了果实损伤接种T. roseum的病斑直径,而且还显著减轻了常温贮藏期间果实的自然发病率。水杨酸处理明显提高了苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酰-辅酶A连接酶（4CL）和肉桂酸羟化酶（C4H）的活性,处理后6 d,其C4H和4CL活性分别比对照高1.0和2.8倍,10 d时PAL活性为对照的1.6倍。此外,处理还显著提高了果实的总酚以及木质素含量,处理后4 d和10 d果实木质素和总酚含量分别高出对照30.6%和30.0%,但处理对类黄酮含量影响不大。【结论】采后水杨酸处理能够通过诱导厚皮甜瓜的苯丙烷代谢增强果实对采后病害的抗性。     

Shade stress decreases stem strength of soybean through restraining lignin biosynthesis

Lodging is the most important constraint for soybean growth at seedling stage in maize-soybean relay strip intercropping system. In the field experiments, three soybean cultivars Nandou 032-4 (shade susceptible cultivar; B1), Jiuyuehuang (moderately shade tolerant cultivar; B2), and Nandou 12 (shade tolerant cultivar; B3) were used to evaluate the relationship between stem stress and lignin metabolism in the stem of soybean. Results showed that the intercropped soybean was in variable light condition throughout the day time and co-growth stage with maize. The xylem area and cross section ratio played a main role to form the stem stress. The B3 both in intercropping and monocropping expressed a high stem stress with higher xylem area, lignin content, and activity of enzymes (phenylalanine ammonia-lyase (PAL), 4-coumarate: CoA ligase (4CL), cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), and peroxidase (POD)) than those of B1 and B2. Among the soybean cultivars and planting pattern, lignin content was positively correlated with stem stress. However, a negative correlation was found between lignin content and actual rate of lodging. In conclusion, the shade tolerant soybean cultivar had larger xylem area, higher lignin content and activities of CAD, 4CL, PAL, and POD than other soybean cultivars in intercropping. The lodging in maize-soybean intercropping can be minimized by planting shade tolerant and lodging resistant cultivar of soybean. The lignin content in stem could be a useful indicator for the evaluation of lodging resistance of soybean in intercropping and activities of enzymes were the key factors that influence the lignin biosynthesis.