嗜酸乳杆菌的体外抑菌研究

[目的]为研究嗜酸乳杆菌的抑菌机理提供一个好的途径。[方法]以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌株,用MRS培养基培养分离纯化嗜酸乳杆菌,利用单层琼脂平板扩散法检测嗜酸乳杆菌在不同pH值条件下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用。[结果]在37℃的恒温箱中培养24 h后,通过测量抑菌圈大小,可以得知嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用。在适宜的酸性条件下,嗜酸乳杆菌对大肠杆菌的抑制作用明显,且随着酸度的增强其抑菌效果愈加明显。嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,但pH值的变化对其抑菌效果影响不大。[结论]在适宜的生长条件下,嗜酸乳杆菌对一些致病菌具有抑制作用。     

石莼醇提物基于细胞膜损伤的抑菌作用

为探究石莼醇提物基于细胞膜损伤的抑菌作用,检测了其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌性能,测定了不同质量浓度石莼醇提物对供试菌生长、核酸和蛋白质的泄露量、培养液电导率的影响,使用流式细胞仪、扫描电镜、透射电镜观察金黄色葡萄球菌菌体损伤率和超微结构的变化.结果表明:石莼醇提物可显著抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的正常生长,尤以对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,其最低抑制浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)分别为1.56、3.13 mg·mL~(-1);2×MIC的石莼醇提物可增大菌体细胞膜通透性,导致菌体内核酸、蛋白质的大量泄露,培养液的电导率极显著上升(P0.01),菌体细胞膜严重萎缩甚至裂解,菌体损伤率可达96.42%.综上,石莼醇提物通过破坏细胞膜的完整性达到抑菌效果.     

毛酸浆果醇提物抑菌机理的初步研究

通过观察大肠埃希菌标准菌株、金黄色葡萄球菌标准菌株生长曲线和菌体超微结构的变化,探讨毛酸浆果醇提物的可能抑菌机理。以金黄色葡萄球菌标准菌株和大肠杆菌标准菌株作为指示菌,在分别绘制细菌生长曲线的基础上,于不同时间点蜕察加药后细菌生长曲线的变化,并以透射电镜观察细菌菌体超微结构的改变。在毛酸浆果醇提物最低抑菌浓度作用下,大肠埃希菌标准菌株生长曲线的各时间点菌体浓度OD值始终保持在0．5以下。透射电镜下可见：大肠埃希菌标准菌株生长0h时,细菌出现明显的分裂相;4h后,大肠埃希菌菌体内部出现许多空泡,分裂相明显减少;8h后,出现较多死亡菌体。毛酸浆果醇提物能有效地抑制大肠埃希菌的生长,使大肠埃希菌的菌体结构出现质壁分离、空泡样变和死亡现象。     

金黄色葡萄球菌耐盐生长的形态观察及机理的初步研究

 为阐明金黄色葡萄球菌特有的耐盐生长特性的机理,试验将该菌分别培养于含低盐（1.0％NaCl）和高盐（10.0％NaCl）的LB液体培养基及卵黄琼脂培养基,观察发现高盐液体条件下该菌呈絮状生长,细菌个体形态明显增大,在高盐固体条件下菌落形态较小,菌落形成单位（CFU）数量也明显减少;对菌体裂解产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析,发现金黄色葡萄球菌在高盐与低盐培养条件下的蛋白表达谱存在差异,前者比后者被诱导多表达出至少一个蛋白质条带（MW 22ku）;将相同数量的该菌接种于含05IU/mL青霉素作为细胞壁合成抑制剂及不同氯化钠浓度（1.0%,2.5%,4.0%,5.5%,7.0%,8.5%和10.0%）的卵黄琼脂培养基上培养,发现随着NaCl浓度的升高,CFU数量逐渐减少。结果表明,金黄色葡萄球菌的耐盐生长特性与其细胞壁合成和盐应激蛋白表达有关,并伴随有菌落、菌体形态的变化。     

不同加工方式对EGCG抑制金黄色葡萄球菌活性作用的影响

[目的]研究经不同加工处理后表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对金黄色葡萄球菌抑菌活性的影响,从而为EGCG在食品生产加工中的抑菌应用提供依据。[方法]利用3种不同加工方式对EGCG进行处理,采用最低抑菌浓度测定法(MIC法)与纸片琼脂扩散法(KB法)检测EGCG的抑菌效果,利用Baird-Parker平板计数法检测EGCG对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制效果。[结果]EGCG抑菌能力随着浓度的增高而提升。相同浓度下,EGCG经过不同加工方式后抑菌能力大小依次为巴氏杀菌法(72℃,20 s)高压蒸汽灭菌法(121℃,15 min)薄膜过滤法(0.22μm),最低杀菌浓度(MBC)依次为0.062 5、0.125 0和1.000 0 mg/m L,经巴氏杀菌法处理的EGCG抑菌效果最强。而EGCG在牛奶中的抑菌作用不显著。[结论]在多种食品加工条件下,EGCG对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。     

超声波对食品污染性菌种破碎效果的影响

[目的]研究超声波对易污染食品的菌种破碎效果的影响。[方法]分别试验不同菌种浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌在不同超声功率、超声时间下的细胞破碎效果。[结果]大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(细菌)对超声破碎较敏感,破碎率在96%以上;黑曲霉菌(真菌)对超声破碎不敏感,其破碎率仅40%左右。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌超声破碎的最佳参数分别为超声功率600 W,超声时间14 min,菌体浓度OD值0.997;超声功率600 W,超声时间15 min,菌体浓度OD值1.440;超声功率700 W,超声时间20 min,菌体浓度OD值0.893。[结论]该研究为超声波技术在食品杀菌上的应用提供了依据。     

食品中金黄色葡萄球菌的PCR检测

建立一种快速聚合酶链反应(PCR)方法,用于食品中金黄色葡萄球菌的检测.针对金黄色葡萄球菌独有的SEA基因设计1对引物,在PCR体系中对相应片断进行扩增,最后通过电泳技术与阳性对照进行对比来判断阴阳性.结果表明,该方法检出率高,样品中模板DNA含量仅有0.05 pg即可检出金黄色葡萄球菌,24 h即可报告结果.因此,PCR方法是一种高效、敏感、特异性高的检测技术,可用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测.     

冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制

研究了冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制。通过测定冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性、呼吸代谢途径和蛋白质合成能力的影响,探讨冬凌草甲素的抑菌机制。试验结果显示,冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为25μg/mL和50μg/mL;冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌后,培养液的电导率升高,β-D-半乳糖苷酶活性增大,核酸外泄量也增加,2 MIC药物组处理6 h后的电导率比空白组升高了18%(P0.01),处理12 h后的β-D-半乳糖苷酶活性比空白组增大了124%(P0.01),胞外核酸大分子含量极显著高于对照组(P0.01);冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌9h,菌体可溶性蛋白质总量比对照组减少了约50%(P0.01);冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌三羧酸循环中的关键酶活性,其中对苹果酸脱氢酶活性抑制率为53.22%(P0.01),对琥珀酸脱氢酶的活性抑制率为33.96%(P0.01)。试验结果表明,冬凌草甲素通过破坏细菌细胞膜的通透性以及抑制菌体内的蛋白质合成、代谢关键酶的活性发挥杀菌作用。     

牛乳中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测法

建立牛奶乳样中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法。根据产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A基因序列分别设计了2对特异性引物,分别从产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌参考菌株的肉汤培养物中提取DNA,进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验和临床样品检测。经过PCR反应条件的优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法,均扩出了相应的目的条带。该方法将参考菌株的肉汤培养物稀释1 000倍后仍可扩出目的条带,且对大肠埃希菌等的PCR检测为阴性。对临床采集的50份乳品样本分别用细菌分离培养法和PCR方法进行检测,两种方法的符合率达90%以上,但双重PCR检测方法具有特异性强和敏感性高的特点。     

冻鸡肉中金黄色葡萄球菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立冻鸡肉中金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌特异性耐热核酸酶基因序列设计2对引物,建立LAMP检测方法,并用于检测采购自贵阳市各大超市的冻鸡肉样品。[结果]设计合成的2对引物和建立的LAMP方法检测金黄色葡萄球菌具有良好的特异性,反应体系的灵敏度为65 CFU/m L。检测采购自贵阳市各大超市和经人为污染的264份冻鸡肉样品分别用LAMP方法检测,并用国标方法检测验证,其特异性为95.2%,准确度为97.3%。[结论]该研究建立的方法为实现在冻鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了良好的基础。     

渭南地区奶牛养殖场生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染状况的调查

【目的】对渭南地区奶牛养殖场生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况进行调查,为保障生鲜牛乳卫生和食用安全提供基础资料。【方法】在渭南市部分奶牛养殖场进行乳样采集,以项目团队建立的金黄色葡萄球菌的A型肠毒素(SEA)、β-内酰胺酶(BLAZ)和耐热核酸酶(NUC)基因的三重PCR方法检测样品中的金黄色葡萄球菌,对阳性样品进行细菌分离;在奶牛养殖场分别调查牛场性质、环境卫生、挤奶前的准备工作、挤奶方式与生鲜奶盛装运输等工作,结合乳样中金黄色葡萄球菌的检出情况,分析以上因素对乳中金黄色葡萄球菌污染的影响。【结果】在14个奶牛养殖场,分7次收集生鲜乳样98份,PCR检测发现金黄色葡萄球菌阳性乳样10份,阳性率10.20%(10/98),其中BLAZ基因阳性样品7份,阳性率7.14%(7/98),SEA基因阳性8份,阳性率8.16%(8/98)。在4个养殖场的乳样中检测到金黄色葡萄球菌,7次采样样品中,金黄色葡萄球菌检测1次阳性的有1个场,2次阳性的2个场,5次阳性的1个场。对这4个养殖场基本情况调查发现,均为家庭小规模养殖(奶牛头数6～9头),挤如后对鲜乳混合后进行零售;5次检测为阳性的牛场存在奶牛与其他动物混养、手工挤奶、挤乳前未对双手和牛乳房进行充分清洗和消毒。【结论】渭南地区奶牛养殖场生鲜牛乳的金黄色葡萄球菌污染率较低,造成金黄色葡萄球菌污染与奶牛养殖环境、挤乳前的消毒工作、挤乳方式密切相关,良好的养殖环境和挤乳方式将大大降低金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染。     

蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究

目的:研究蝎子草醇提浸膏(Girardinia suborbiculata C.J.Chen ethanol extract,GSEE)对金黄色葡萄球菌的抗菌机制.方法:测定蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC),通过GSEE对菌体生长曲线、菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸合成等的影响来对GSEE的抗菌机制进行研究.结果:GSEE对金黄色葡萄球菌的MIC为100 mg/mL,可明显抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂;SDS-PAGE电泳表明,金黄色葡萄球菌的可溶性蛋白含量在GSEE作用后的条带明显少于对照组;同时,通过DAPI染色显示,GSEE对菌体的核酸合成具有显著抑制作用.结论:GSEE对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌作用,其抗菌机制可能通过抑制菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸的合成等方面来实现抑制金黄色葡萄球菌的生长.     

红曲霉产色素发酵条件优化及抑菌性能的测定

优化了3株红曲霉(Mg、M6、M8)产红曲色素的发酵条件:接种量5.0%、培养温度30℃、培养时间72 h、初始pH 6.0.选择产色素最高的Mg菌株,用番薯淀粉培养液进行上罐发酵分析,探讨了Mg菌株液体深层发酵过程中色素产量的变化规律,整个发酵过程分为3个阶段:0～40 h是菌体大量生长阶段,色素产量很低;40～90 h是色素生成期,色素生成稳定且产量高;90 h以后菌体生成和产色素能力下降.色素效价最高达到29.71 U·mL-1.测定了色素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,当培养液中的色素效价为0.9 U·mL-1时,就开始抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长,色素效价达到3.6 U·mL-1时,其抑菌率也不再增大.     

生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素检测

为了解生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌污染状况及产肠毒素特性,进而为金黄色葡萄球菌引起的食物中毒监测以及污染源追踪提供依据,本试验从山东省两个地市采集生鲜牛乳共152份,对其进行金黄色葡萄球菌检测,并对地市1样品进行产肠毒素检测。结果显示,152份样品共检出金黄色葡萄球菌阳性样品84份,检出率为55.26%,其中,地市1的114份样品中共检出被金黄色葡萄球菌污染的样品63份,检出率为55.26%;地市2的38份样品中共检出被金黄色葡萄球菌污染的样品21份,检出率为55.26%,且不同地区来源的样品受污染程度存在明显差异。对地市1的样品进行肠毒素检测,均未检出肠毒素。本研究结果表明,两个地市生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌污染范围较广,应进一步加强奶源管理,避免由其污染引起的食物中毒。     

枯草芽孢杆菌抑菌活性及蛋白粗提物特性研究（英文）

为了获得无耐药性、无毒副作用的生物药物,减少抗生素的使用,从动物肠道中分离到一株芽孢杆菌,用分子生物法鉴定分离菌;用琼脂扩散法做分离菌体外抑菌试验;用常规培养法筛选分离菌最佳发酵条件;用饱和硫酸铵法提取分离菌抑菌粗蛋白;用比对法检测抑菌粗蛋白的理化特性;鉴定分离菌为枯草芽孢杆菌;对金黄色葡萄球菌、猪丹毒、链球菌有抑菌作用;当温度为30℃、酸碱度为pH7、装液量为75 ml/250 ml、接种量为20%、培养时间为48 h,分离菌发酵效果最好;用80%饱和硫酸铵提取抑菌粗蛋白的方法最好;抑菌粗蛋白有较强的抗热和抗酸能力;有机溶剂、紫外照射对抑菌粗蛋白有一定的影响;蛋白酶类对抑菌粗蛋白有一定的水解作用。所分离的枯草芽孢杆菌可用于防治因金黄色葡萄球菌、猪丹毒、链球菌等引起的疾病,也可加到膨化饲料中用于肠道微生态的调节。     

MSL抗菌肽对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的损伤作用研究

通过MSL抗菌肽(MSL)对细菌细胞膜的损伤作用研究,确定该抗菌肽的作用靶点。在1×108个/m L的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌悬液中,分别加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育,分别于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min、240min离心收集上清液,检测各时间点蛋白浓度,分析蛋白浓度变化规律;分别在对数生长期的金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌悬液中加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育60min后,利用透射电镜观察分析细菌结构的变化。结果,MSL与2种细菌接触后均可引发胞液外流;透射电镜观察发现,MSL可造成绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜破损,胞浆内电子密度降低,染色质聚集,严重者细胞崩解结构不清,说明MSL对G+和G-细菌细胞膜均可造成损伤,证明细菌细胞膜是MSL作用的靶点之一。     

金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结果显示分离培养的牛乳腺上皮细胞表达角蛋白8;金黄色葡萄球菌感染牛乳腺上皮细胞3 h后,可诱导牛乳腺上皮细胞发生凋亡,表现为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型凋亡特征;Annexin V/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,差异极显著（P﹤0.01）;与对照组相比,感染组细胞caspase3及caspase 8表达量明显增高。【结论】金黄色葡萄球菌可以诱导牛原代乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征和生化特性,凋亡通路可能涉及caspase 3和caspase 8参与的外源性凋亡途径。     

PCR法检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

[目的]建立一种快速准确检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。[方法]将金黄色葡萄球菌模拟污染的水增菌后提取菌体DNA,以沙门氏菌、大肠杆菌DNA和空白作对照,用PCR法扩增金黄色葡萄球菌肠毒素A基因。[结果]金黄色葡萄球菌DNA的检测结果呈阳性,检测底限达100 cfu/L,而大肠杆菌和沙门氏菌及空白对照均未出现特异性片段,整个检测过程只需要24 h。[结论]试验建立的PCR方法可检测水及类似食品中的金黄色葡萄球菌SEA基因,并具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的特点。     

拮抗菌X23发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制作用

为了解拮抗菌X23发酵液对金黄色葡萄球菌的杀菌作用及机理,将拮抗菌X23发酵液与金黄色葡萄球菌作用后,运用琼脂平板倾注法检测菌体克隆数,扫描电镜观察菌体形态,透射电镜观察菌体超微结构。结果表明:拮抗菌X23发酵液与金黄色葡萄球菌作用60、90、120 min后,金黄色葡萄球菌克隆数极显著低于生理盐水对照组(P<0.01);与拮抗菌X23发酵液作用60 min后,金黄色葡萄球菌菌体表面出现囊状小突起,细胞膜皱褶并最终破裂,菌体内出现大块透电子区,胞浆内容物稀疏,胞质不均匀,胞内空泡变性加重,分裂相减少,菌体溶解。推测拮抗菌X23发酵液可以通过破坏细胞膜结构而杀死金黄色葡萄球菌。     

乌梅有机酸提取条件优化及其对生物膜形成的抑制作用

对乌梅总有机酸的提取条件进行优化并研究其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物膜产生的抑制作用。通过单因素试验及正交试验对乌梅总有机酸提取条件进行了优化及验证,采用结晶紫染色法对金黄色葡萄球菌生物膜形成量进行了测定。结果表明,乌梅总有机酸最佳提取条件为乙醇70%(体积分数)、料液比3∶40(g∶mL)、超声提取时间1.5 h及超声提取温度50℃。在该条件下,乌梅总有机酸提取率为24.50%。提取物浓度为0.5MIC、MIC和2MIC时,对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制率分别为13.06%、48.24%和74.01%。因此,该提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有抑制作用。