鳜黏膜淋巴组织结构的初步研究

采用组织学和电镜技术,应用HE常规染色方法、AB-PAS黏液细胞染色方法、免疫组织化学方法,对鳜(Siniperca chuats)黏膜淋巴组织的基本结构以及免疫相关细胞的形态、类型及其在黏膜淋巴组织中的分布情况进行了研究.结果表明,鳜的鳃弓、鳃小片基部、皮肤的表皮以及肠上皮中存在大量的黏液细胞,用AB-PAS染色方法将鳜黏液细胞分为6种类型;免疫组化方法可在鳃的血窦腔、皮肤的基底层以及肠黏膜层中检测到抗体分泌细胞的存在;透射电镜观察显示,黏膜淋巴组织中存在着黏液细胞、淋巴细胞、浆细胞、吞噬细胞、肥大细胞、朗罕氏细胞、嗜中性粒细胞等免疫相关细胞.结论认为,鳜黏膜淋巴组织具有完成免疫应答的细胞基础.     

军曹鱼消化系统胚后发育的组织学研究

本文利用连续石蜡切片方法对军曹鱼消化系统胚后发育（1～29日龄）进行了光镜观察。结果表明食道前部内侧纵行肌纤维发达,后部球形粘液细胞更丰富;胃腺的分化较晚,在仔鱼后期(即出膜后8天)才见胃腺细胞团。胃幽门部无胃腺,但具发达的肌层。肠上皮的纹状缘出现较早,1日龄时就可见,而且发育较快,3日龄时很发达。 肠后段黏液细胞明显多于前段和中段。肝脏发育较早,但16日龄仔鱼才开始贮存脂质。胰腺为弥散型,2日龄出现。军曹鱼这些结构特点的变化是与其摄食、消化、吸收的功能相适应的,而且,军曹鱼的摄食方式以及食性也随着消化系统的发育而变化。     

军曹鱼淋巴器官发育的形态学研究

运用组织学及组织化学的染色方法,对出膜后第1～44天(Days post-hatch,dph)的军曹鱼Rachycentron canadum头肾、脾脏和胸腺发育过程进行研究.首先观察到前肾管,3 d后,在肾管附近发现原始的造血千细胞,逐渐有红细胞和大淋巴细胞产生.之后,脾脏出现,其内毛细血管和红细胞丰富,还分布少量巨噬细胞.胸腺虽然是最后出现的淋巴器官,但是发育的非常快,内外分区明显.可以得出其淋巴器官出现顺序是头肾、脾脏和胸腺.在小淋巴细胞出现前,发现各淋巴器官内存在一些与非特异免疫机制相关的细胞,如巨噬细胞和网状细胞等.淋巴器官原基出现后开始淋巴化,其顺序是胸腺、头肾和脾脏.在采样的时间段里未观察到浆细胞,可能军曹鱼淋巴器官至此仍未发育成熟.     

军曹鱼淋巴囊肿的病理学研究

应用病理组织学和电镜方法,对患疑似淋巴囊肿病的军曹鱼(Rachycentron canadum)的各器官进行观察.结果表明,患病军曹鱼的皮肤囊肿组织由一些淋巴囊肿细胞集合体组成,这些囊肿细胞排列紧密,直径为10～150 μm,细胞呈圆形、锥形不规则状;细胞外有一层厚的囊膜;细胞质内散布有大量的嗜碱性包涵体,且多数集中在细胞的边缘部分;电镜观察到囊肿细胞质中有大量二十面体的病毒粒子,病毒颗粒直径220 nm.据此确认该病为病毒性淋巴囊肿病.其他器官主要组织病理学变化有:在心脏、肝脏、脾脏和头肾中也存在囊肿细胞,心肌纤维水肿;肾间质淋巴细胞增生,巨噬中心出现,肾小管上皮细胞变性和坏死;脾淋巴细胞增生,脾髓质出血;肝脂肪变性;鳃上皮肿胀.根据观察结果可以认为,该病毒不仅损伤鱼的皮肤,致使病鱼外观异样而严重影响其商品价值,而且对鱼的内脏和免疫器官也造成严重的致命损伤.     

军曹鱼Ig μ重链的全长克隆及在各组织中的定量分析

采用同源克隆和RACE技术,克隆了军曹鱼Igμ重链的cDNA全序列,并通过荧光定量技术分析其在组织中的表达。军曹鱼Igμ的cDNA全长1933bp,3的非编码区域(UTR)为164bp,5UTR为26bp,开放阅读框为1743bp,编码580个氨基酸,分子量为64.831ku,理论等电点6.6。推测的军曹鱼Igμ全长氨基酸序列与已报道的鱼类的相似性最高为60%,最低为30%,同两栖类的相似度在30%~33%,同其他高等的动物相似度不足30%。较保守的CH4区和鱼类相似性在64%~71%,同其他生物的相似度仅为31%~33%,具有较强的物种特异性。军曹鱼Igμ中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点以及FR2骨架区的GKGLEW和在FR3的YYCAR保守序列。Igμ链基因在健康鱼体中除了肾以外在其它各组织中均有表达,在肠中的表达量最高。经鲨鱼弧菌刺激48、96、192h后,在采样的各个组织中均有表达,心脏、鳃、肠道在刺激后48h表达量明显增加,脾脏、胃和脑0h时的表达量较高,肝脏、头肾以及肾脏192h后表达较显著。从时间上看,黏膜免疫屏障最先抵御外来抗原,其后,依次是肝脏、肾、头肾产生免疫应答,说明系统免疫在长时间的抵御外来抗原时发挥着重要作用。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡后鳜IgM基因表达量和抗体效价的变化

应用荧光定量PCR技术,研究了嗜水气单胞菌疫苗浸泡免疫后,鳜(Siniperca chuatsi)鳃、皮肤、脾脏和头肾中IgM基因表达量变化,同时应用ELISA检测皮肤黏液和血清中抗体滴度变化。结果显示:最早检测到IgMmRNA转录水平上调的是皮肤和鳃(第4天),而脾脏和头肾在第7天才达到高峰。IgM基因在头肾和脾脏中表达量较高(高峰值分别达到16.3和23.8),皮肤和鳃中的表达量较小(高峰值分别为4.3和8.6)。抗体效价方面,皮肤黏液中抗体滴度峰值出现时间较早(第7天),但抗体从开始形成到消失持续时间较短(28 d);血清中抗体滴度峰值出现时间较迟(第21天),但持续较长(42 d)。结果表明:浸泡免疫能够引发鳜机体和局部均出现免疫应答。从抗体滴度和IgM基因表达量方面考虑,系统免疫组织均高于黏膜免疫组织,表明前者是合成IgM的主要场所。从时间上比较,对抗原刺激最早做出应答的是皮肤黏膜和鳃,其后系统免疫才表现应答作用,这表明了局部黏膜能够在抗原入侵的早期起到抵制作用。     

军曹鱼的生物学特性及人工繁殖

军曹鱼亦称海鲡,隶属鲈形目、军曹鱼科、军曹鱼属,分布于大西洋、印度洋和太平洋(东太平洋除外)等热带水域,其个体最大可达1．5 m,体重43 kg。 1 生物学特性 1．1 外部形态特征军曹鱼体延长,近圆筒形,稍侧扁。头扁平,宽大于高。眼较小,位于头的两侧,无脂膜。口大,前位,下颌稍长于上颌。上下颌、犁骨、腭骨及舌面均有绒毛状牙带。前鳃盖骨边缘平滑。体、颊部、鳃盖上     

军曹鱼仔稚鱼脊柱和附肢骨骼的发育特征

为探明军曹鱼仔稚鱼早期脊柱及附肢骨骼的发育特征,本研究采用软骨-硬骨双染色技术,分别利用阿利新兰、茜素红对软骨、硬骨以及1～33日龄军曹鱼仔稚鱼全骨骼进行染色,系统观察并描述其脊柱和附肢骨骼的发育特征。结果显示,军曹鱼脊柱开始发育的标志为7日龄仔鱼中脉弓和神经弓的出现;13日龄稚鱼椎骨、神经弓和脉弓开始骨化;背肋、腹肋分别于17、20日龄开始骨化;29日龄稚鱼脊柱骨化完成。附肢骨骼骨化起始顺序依次为胸鳍、尾鳍、腹鳍、背鳍和臀鳍。胸鳍匙骨于4日龄出现,肩胛骨孔于12日龄出现,同时上匙骨开始骨化;乌喙骨与肩胛骨于20日龄开始骨化;第1尾下骨于5日龄出现,15日龄稚鱼尾杆骨、侧尾下骨和尾鳍鳍条开始骨化,18日龄稚鱼尾下骨开始骨化;腹鳍支鳍骨于17日龄延伸至匙骨,同时腹鳍开始骨化;臀鳍和背鳍于17日龄由前向后开始骨化。研究表明,军曹鱼在13日龄进入稚鱼期,早期发育阶段的骨骼发育特征与其功能性适应密切相关。本研究结果对研究军曹鱼早期骨骼发育与功能适应、优化养殖条件有重要作用。     

军曹鱼白细胞介素1β基因的克隆、分析及表达

采用同源克隆和锚定PCR技术，从军曹鱼(Rachycentron canadium Linnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin-1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL-1β的cDNA全长1104bp，3′非编码区域(UTR)为255bp，5′UTR为108bp，开放阅读框(ORF)为741bp，编码246个氨基酸，分子量大约为27．68kD，理论等电点为5．71。同源性分析表明，该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL-1β基因具有很高的相似性，并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时，利用RT—PCR技术，对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究，发现IL-1β基因在鱼体的多种组织中都有表达，而经过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，目的基因在组织中的表达明显增加，但是在不同组织内的表达存在差异。研究显示，军曹鱼IL-1β基因存在组成型和诱导型2种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

吉富罗非鱼sIgM基因多克隆抗体的制备及组织定位分析

为研究sIgM在吉富罗非鱼体内的组织分布及其在亚细胞水平上的定位,本实验利用纯化的SIGM融合蛋白,按照常规方法免疫新西兰大白兔,制备了兔抗吉富罗非鱼SIGM多克隆抗体;并对吉富罗非鱼肠、脾脏及鳃组织进行了免疫组织化学分析以及胶体金免疫电镜分析。结果显示,ELISA检测所获得的抗血清效价为1∶256 000,该血清能与SIGM融合蛋白发生特异性免疫反应。在肠和鳃组织中,阳性信号存在于富含黏液细胞的上皮细胞层表面,在杯状细胞和黏液细胞中则不存在;在脾脏组织中,阳性信号存在于特定的细胞中。免疫电镜结果显示SIGM主要存在于肠上皮细胞膜附近,并且在肠组织上皮细胞膜表面的微绒毛处含量较多;在鳃上皮组织中,SIGM主要存在于包围鳃丝和鳃小片的上皮细胞及部分红细胞内;而在脾脏组织淋巴细胞内部高尔基体的分泌小泡处存在大量的胶体金颗粒。研究表明,sIgM在鱼体黏膜免疫中具有重要作用,这为探讨鱼类sIgM的特性及功能奠定了基础,并丰富了鱼类黏膜免疫的研究内容。