柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选

以柱花草奥克雷品种为材料，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化，建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明：20 μL为最佳反应体系，酶切体系中DNA模板量为1 000 ng，用5 U EcoR I 37℃酶切2 h、5 U Mse I 65℃酶切2 h效果最佳；分别取5 μL酶切液、1 μL T4连接酶(5 μL/L)、1 μL EcoR I接头、1 μL Mse I接头、2 μL缓冲液(T4DNA酶自带)，于22℃下连接10 min效果最佳；预扩增体系中模板稀释15倍、Mg2+浓度为0.75 mmol/L、Taq酶用量为1 U、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为2 ng/μL效果最佳；选择扩增体系中模板稀释20倍、Mg2+浓度为1.25 mmol/L、Taq酶为1 U、dNTPs浓度为0.225 mmol/L、引物浓度为0.4 ng/μL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选，筛选出46对引物组合，为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础。     

菰SRAP-PCR反应体系的优化与建立

利用单因素分析法对影响菰SRAP-PCR扩增效果的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板和引物浓度5种因素进行了优化。结果表明:建立了适合菰基因组的SRAP-PCR的体系:1μL 10×Buffer、0.5 U Taq DNA聚合酶、2 mmol/L MgCl2、50 ng模板DNA、0.20 mmol/L dNTPs、正反向引物的浓度各为0.7μmol/L,共10μL。选取5对引物,利用该体系对72份菰样本进行PCR扩增,共获得132条清晰的谱带,其中91条具有多态性,比率为68.9%。菰SRAP-PCR反应体系的优化和建立将为利用该标记进行种质遗传多样性分析和连锁图谱构建等研究提供技术支持。     

利用ISSR分析21份毛叶枣种质的亲缘关系

为探讨收集保存的毛叶枣种质的亲缘关系,运用正交设计建立优化毛叶枣ISSR反应体系。结果表明:即25μL PCR体系中含2.5μL的10×PCR Buffer、3.75μL的2.5 mmol/L dNTPs、1.5μL的0.5 U/μL Taq酶、1.5μL的5μm/L引物,0.75μL的100 ng/μL DNA。然后利用ISSR标记对21份毛叶枣材料进行分类研究,并从100条引物中筛选13条扩增条带数量丰富、清晰、稳定的引物用于亲缘关系分析。结果显示:共扩增条带98条,其中多态性条带78条,多态性百分率85.7%;根据ISSR扩增结果,21份材料遗传相似系数范围为0.51~0.90。通过UPGMA法进行聚类分析,在遗传相似系数0.67水平,21份毛叶枣种质可分为3类:第I类为蜜丝枣1个种质;第Ⅱ类均来自台湾品种群,有17个种质;第Ⅲ类滇刺枣野生种、缅甸长果种和缅甸圆果种。大多数品种间相似性系数在0.67以上,说明保存种质的遗传多样性较低。     

橡胶树MSAP技术体系的优化与建立

通过对酶切反应最少酶用量及选择性扩增体系的优化,建立了橡胶树MSAP最佳反应体系。研究结果表明,500 ng橡胶树叶片基因组DNA,用EcoRⅠ、HpaⅡ和MspⅠ各0.5 U,在37℃酶切4 h,即可完全酶切。优化的选择性扩增体系为:Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、引物0.15μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U;使用该体系,可获得清晰稳定的橡胶树MSAP图谱。     

茶树SRAP反应体系优化及引物筛选

以茶树叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2+、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、模板DNA 5种因素5个水平,对茶树SRAP反应体系进行了研究,建立了茶树SRAP最佳反应体系。结果表明,茶树SRAP最佳反应体系为:Mg+22.0mmol/L、引物各0.5μmol/L、dNTP 0.1mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5U/μL、模板DNA 4ng/μL,总体积为10μL。运用该体系,从128个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的56个引物组合。这一体系的建立及引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行茶树分子遗传学研究提供了理论依据。     

利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对甘蔗SRAP-PCR反应体系的五大因素(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶)在4个水平上进行优化,得到如下结论:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次是:Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA;通过对各因素进行筛选,建立甘蔗SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为:dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。     

芒果ISSR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对芒果ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化试验,通过不同反应体系扩增效果比较,建立优化的芒果ISSR反应体系,即25μL的PCR体系中含有DNA模板25 ng、Mg2+浓度为1.5 mmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L、引物0.32μmol/L、Taq DNA聚合酶1.25 U。这为进一步运用ISSR标记在DNA分子水平上对芒果种质资源进行分析奠定基础。     

芒果SSR-PCR反应体系的优化

通过正交实验,以芒果品种金煌芒为材料,对影响芒果SSR-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq酶、模板DNA、引物这5个因素进行了优化。结果表明,各因素水平变化对PCR反应影响的显著性依次为:模板DNAdNTPs引物Mg2+Taq酶。最终确立SSR反应体系的最优条件为:20μL体系中,10×buffer2μL,模板DNA80ng,dNTPs0.4mmol/L,引物0.2μmol/L,Mg2+1.8mmol/L,Taq酶0.75U。     

荷花ISSR—PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR—PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2＋浓度、TαDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR—PCR分析的最适宜的PCR反应体系：20μL PCR反应体积含O．4mmol·L-1 dNTPs、3．5mmol·L-1Mg2＋、1．5U TαqDNA聚合酶、0．4μmol·μL-1引物、3ng模板DNA。PCR扩增程序为：94℃预变性2min,94oC变性30s,54．5℃退火30s,72℃延伸1min,45个循环,最后72℃延伸7min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

茶树ISSR-PCR反应体系的建立

通过优化影响茶树 ISSR-PCR 的主要参数,确立了适用于茶树的 ISSR 反应体系和扩增条件。结果表明在 20 μl 反应体系中,模板 DNA、引物、Mg++、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶五种主要成分的最适浓度分别为 10ng、150 nmol/L、1.5 mmol/L、150 μmol/L、0.5 U。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其 Tm 值平均高 4.5℃,扩增出足量产物至少需要 30 个热循环。利用该优化反应体系和扩增条件,对 13 份不同茶树种质资源进行ISSR-PCR 扩增,扩增产物的多态性为 77.6%。引物 TRI18 构建的 ISSR 指纹图谱,可以区分 13 份茶树资源中的 12 份,分辨率达 92.3%。     

琼脂糖凝胶电泳在水稻EcoTILLING技术中的应用

为构建低成本的基于琼脂糖凝胶电泳的EcoTILLING技术体系,用于水稻及其他生物自然群体变异的检测,对基于琼脂糖凝胶的EcoTILLING技术进行了优化。结果表明,从芹菜中提取的CEL Ⅰ核酸酶粗提物结合琼脂糖凝胶电泳检测技术,可以成功地检测到目的基因位点的突变。利用该技术,在云南地方水稻品种大吊糯中检测到2 个SNPs。     

毛细管电泳分析茶黄素的方法研究

研究了毛细管电泳分析茶黄素类组分的最佳条件。结果表明：在250βmmol/L H₃BO₄、10βmmol/L KH₂PO₄、0.75βmmol/L SDS和20％(v/v)乙腈组成的pH7.5电泳介质中,选择25βkV电压、20℃柱温和200βnm波长检测,可在10βmin以内将茶叶中的四种主要茶黄素单体分离,并获得较高的检测灵敏度。四种茶黄素单体浓度与峰面积值之间的相关系数r=0.9945~0.9990,检测下限在0.53~0.64βμg/ml之间,加标回收率为92.50%~108.36%,变异系数≤2.67%。本方法快速、准确,可用于实际样品的测定。     

外源NO对低温胁迫下‘胭脂茄’种子萌发及幼苗生理特性的影响

以闽西地方茄子品种‘胭脂茄’种子和幼苗为试材,用不同浓度SNP（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5 mmol/L）浸种6 h,分别在28℃和4℃暗培养处理3 d后转入培养箱进行常规培养萌发,统计各处理的发芽指标;对胭脂茄幼苗叶面喷施不同浓度SNP（0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L）预处理3 d后,于10℃/5℃下进行低温胁迫,通过测定幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重及叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性,可溶性蛋白和脯氨酸含量以及丙二醛（MDA）含量,研究低温胁迫下外源一氧化氮（NO）预处理后对种子萌发、幼苗生长及相关生理生化特征的影响。结果表明,外源NO供体SNP预处理后,胭脂茄种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数的变化趋势均随着SNP浓度的升高呈先增加后减少变化,SNP浓度为0.2 mmol/L时,种子萌发各指标达到最大,SNP浓度超过0.5 mmol/L时各指标降低;施加低浓度（0.1~1.0 mmol/L）SNP预处理能够增加胭脂茄幼苗株高、茎粗、鲜重和干重,可以增加幼苗叶片中可溶性蛋白和脯氨酸含量、提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性,降低幼苗叶片中MDA累积,SNP浓度为0.5 mmol/L时CAT活性最高,其余各项指标以SNP浓度为0.8 mmol/L时达到最佳,高浓度SNP对各项指标产生抑制作用。研究结果表明低温胁迫下低浓度SNP预处理后可有效保护胭脂茄种子萌发和幼苗生长,浓度过高反而造成伤害。本研究结果为合理使用外源NO促进胭脂茄种子萌发和幼苗生长提供理论依据,为闽西地区有效防御茄子低温冷害提供应用价值。     

茶树叶绿体基因组SNP分子标记的初步研究

传统的叶绿体基因分子标记在茶组植物分类系统研究中的应用价值相对有限,为了筛选可用于茶树鉴别与母系溯源的SNP（单核苷酸多态性）位点组合,将18个已报道的茶组植物叶绿体全基因组序列进行比对,通过设计通用引物,在169个茶树品种/品系中进行候选分子标记扩增与一代测序分析,筛选出16对引物,共含25个SNP位点可用于茶树品种母系溯源与鉴别分析。另外,将SNP位点组成的DNA指纹图谱结合茶树品种资源基本信息进行数字编码,最终形成由30位数字组成的茶树品种资源分子身份证,并构建相应的条形码和二维码用于品种识别。本研究数据为茶树品种的母本溯源与鉴别提供新的思路。     

一种大豆SNP分型新方法

单核苷酸多态性(SNP)在大豆基因组中分布广泛,SNP分型是大豆SNP遗传作图,关联分析、分子标记辅助选择等研究的重要技术.本文以Rhg4基因开发的5个SNP为例,介绍了一种大豆SNP分型的新方法-片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR).采用AS-PCR原理,针对某个SNP位点设计2条相差4-5bp的特异引物和1个公用引物,PCR产物约100bp或150bp,2种等位基因型PCR产物相差4-5bp,在2个特异引物3'端第3和4碱基位置分别人为引入错配碱基来提高PCR特异性,通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可将纯合和杂合基因型检测出来.探讨了特异引物浓度和退火温度对Rhg4-1592扩增效果的影响,研究表明,可通过调整特异引物浓度和退火温度优化扩增效果.FLDAS-PCR对18份种质分型结果与PCR产物克隆测序法一致,表明本研究建立的FLDAS-PCR法是一种简便、快捷、新型的大豆SNP分型方法.     

毛细管离子分析法测定茶叶中的锌、锰、铜、铅和镉

用毛细管离子分析(CIA)法测定了茶叶中的锌、锰、铜、铅和镉,在10mmol/L咪唑,10mmol/Lα-羟基乙酸,pH=4.0的电泳介质中,五种离子在10min内得到了分离,用间接紫外法检测,以外标法定量,五元素的线性关系良好,相关系数为0.9973~0.9997,平均回收率在96.4%~104.2%之间,相对平均偏差为2.1%~3.3%,检测限为0.02~0.2μg/ml。此方法快速简便、准确度高、测定成本低。     

丝网印刷碳电极传感器检测茶叶中痕量铅研究

建立了同位镀汞法修饰的丝网印刷碳电极电化学方波溶出伏安法快速检测茶叶中的铅的方法。详细描述了建立该系统检测方法的条件优化过程,得到了一系列最佳参数:最佳的镀汞液浓度4×10-4mol/L,沉积电位-1.1V,电位增量3mV,方波频率10Hz,方波幅度0.05V,pH值5,沉积时间280s,平衡时间30s。在优选条件下获得的方法灵敏度、线性范围和检测限分别为22.7nA/(μg/L),10~225μg/L(r=0.9986)和0.74μg/L(S/N=3)。研究了对多种重金属元素存在条件下120μg/L的铅检测的干扰情况。本试验对样品前处理方法研究发现,采用家用微波炉、聚四氟乙烯密封增压微波消化罐消化茶叶,用标准加入法对分析样品进行检测,与国标方法相比较,无显著偏差。该方法灵敏、准确、快速适合于茶叶中痕量铅的测定。     

茶树多酚氧化酶基因的PCR-RFLP多态性分析

采用PCR-RFLP技术,检测茶树多酚氧化酶(PPO)基因中4个限制性核酸内切酶酶切位点在不同品种中的多态性,以研究其与品种适制性及遗传背景的关系。遗传参数分析表明:4个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),HpaⅡ酶切位点(引物L7/L8扩增区段)呈现高度多态,BsuRⅠ酶切位点呈现中度多态,这2个酶切位点在不同品种中的基因型分布与品种的遗传背景有直接的关联,可作为遗传标记应用于茶树品种遗传亲源关系分析与亲子鉴定。HpaⅡ酶切位点在引物L7/L8扩增区段存在丰富的多态性,且与品种适制性具有明显关联,适制红茶的品种多为AA基因型,此位点能被HpaⅡ内切酶完全酶切;适制绿茶与乌龙茶的品种多为BB型或AB型,此位点不能被酶切或不能完全被酶切,该HpaⅡ酶切位点可作为茶树品种适制性早期鉴定的遗传标记。对引物L7/L8扩增区域的HpaⅡ酶切位点在祁门4号×潮安大乌叶F1代群体进行分型检测的结果表明,该位点在F1代的分离符合孟德尔遗传规律(x2=0.23)。     

外源一氧化氮对盐胁迫下水稻根部脂质过氧化的缓解作用

 在100 mmol/L NaCl的胁迫条件下，研究了两种浓度的一氧化氮供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）处理对水稻幼苗根部脂质过氧化的影响。低浓度（10 μmol/L）的SNP处理明显缓解盐胁迫下水稻幼苗根组织膜脂过氧化产物MDA的累积，显著提高可溶性蛋白含量，并诱导根系APX、POD和SOD活性的上升；而高浓度（50 μmol/L）SNP处理的效果则基本相反。表明外源低浓度NO可以通过提高盐胁迫下水稻幼苗根组织的抗氧化能力来缓解氧化损伤。