菜薹叶片衰老相关转录因子BrWRKY75的特性分析

以菜薹[Brassica rapa L. ssp. chinensis（L.）Mokino var. utilis Tsen et Lee]为材料,克隆得到1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY75。氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY75与拟南芥的WRKY75同源性较高,且同属于第Ⅱ类c亚族。实时荧光定量PCR表明BrWRKY75在菜薹叶片衰老过程中表达明显增强。亚细胞定位和转录活性分析显示BrWRKY75定位于细胞核,是一种核蛋白,并且具有转录抑制活性。体外凝胶阻滞试验（EMSA）证实BrWRKY75能与W-box（TTGAC）元件特异结合。上述结果为进一步研究菜薹叶片衰老的转录调控机制奠定了基础。     

菜薹BrNAP克隆及其在采后叶片衰老中的功能分析

在菜薹(Brassica rapa var. parachinensis)中克隆Br NAP1并分析其功能。Br NAP1编码区全长813 bp,编码270个氨基酸,具有NAP转录因子特有的保守结构域,属于NAP亚家族成员。Br NAP1表达量与叶片衰老程度呈正相关且受ABA诱导表达上调。亚细胞定位试验表明Br NAP1定位于细胞核。互补试验显示Br NAP1能使拟南芥atnap滞绿表型回复至野生型,过表达则能引起采后叶片早衰。双荧光素酶试验表明Br NAP1能够激活Br SAG113表达。这些说明Br NAP1是菜薹采后叶片衰老的正调控基因。     

菜薹BrNAP克隆及其在采后叶片衰老中的功能分析

在菜薹(Brassica rapa var. parachinensis)中克隆Br NAP1并分析其功能。Br NAP1编码区全长813 bp,编码270个氨基酸,具有NAP转录因子特有的保守结构域,属于NAP亚家族成员。Br NAP1表达量与叶片衰老程度呈正相关且受ABA诱导表达上调。亚细胞定位试验表明Br NAP1定位于细胞核。互补试验显示Br NAP1能使拟南芥atnap滞绿表型回复至野生型,过表达则能引起采后叶片早衰。双荧光素酶试验表明Br NAP1能够激活Br SAG113表达。这些说明Br NAP1是菜薹采后叶片衰老的正调控基因。     

猕猴桃后熟过程中ABA响应结合因子AcAREB1调控AcGH3.1的表达

以‘红阳’猕猴桃为试材,研究脱落酸(ABA)对果实采后成熟过程中生长素(IAA)代谢的影响。结果表明,外源ABA处理能够加速自由态IAA的降解,提高IAA-Asp含量,同时可以显著促进IAA降解相关基因AcGH3.1的表达。从猕猴桃基因组数据库中分离鉴定到5个ABA响应结合因子基因(AcAREB1～AcAREB5),荧光定量PCR显示,5个基因在果实采后成熟过程中均能不同程度响应ABA。酵母单杂交结果显示,AcAREB1能够直接结合到AcGH3.1的启动子上。亚细胞定位显示AcAREB1定位在细胞核上。酵母自激活试验表明AcAREB1具有转录激活活性。这些结果表明,在猕猴桃果实成熟过程中,AcAREB1可以响应ABA,调控AcGH3.1的表达,从而促进IAA的降解,最终使得果实开始软化成熟。     

香蕉MaTIFY1转录因子特性及其在成熟过程中基因表达分析

从香蕉果实中分离获得1个TIFY亚族的转录因子基因,命名为MaTIFY1。该基因含有一个681 bp的ORF,编码一条长度为227 aa,分子量为24.97 kD,等电点为7.85的氨基酸多肽链。MaTIFY1定位于细胞核,并且具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MaTIFY1随着香蕉果实成熟进程表达明显增强,并且外源丙烯处理可诱导其表达。此外,MaTIFY1启动子活性受乙烯利诱导激活,进一步表明MaTIFY1可能参与香蕉果实成熟的调控。原核表达并纯化了MaTIFY1重组蛋白。     

喀西茄WRKY基因的分离及其受黄萎病诱导的表达分析

利用已获得的喀西茄（Solanum aculeatissimum）接种黄萎病前后的根部转录组数据库,前期筛选得到了4个与植物WRKY转录因子蛋白一致性较高的Unigene序列。系统进化分析表明,这4个转录因子均含有典型的WRKY结构域,分别属于WRKY蛋白家族的第IC类、IIa类和III类。利用实时荧光定量PCR技术分析了这4个WRKY基因在喀西茄不同组织（根、茎和叶）以及接种黄萎病后根部不同时期的表达情况,结果表明,Unigene6502和Unigene20920在根部的表达量显著高于茎部和叶片,而CL1273.Contig2和CL3641.Contig1在叶片的表达量显著高于根部和茎部。这4个WRKY基因在喀西茄根部接种黄萎病菌后具有不同的表达模式,Unigene6502和Unigene20920接种后呈先上调后下调的表达模式,CL1273.Contig2和CL3641.Contig1分别呈上调和下调的表达模式。     

葡萄Trihelix转录因子家族生物信息及其基因表达分析

利用生物信息学分析、预测葡萄Trihelix转录因子家族基因的特性与功能,为葡萄抗逆基因的挖掘和利用提供理论依据。以‘红地球’葡萄(Vitis vinifera)试管苗为试验材料,对葡萄Trihelix转录因子家族进行理化性质、染色体定位、二级结构预测、亚细胞定位、基因结构分析、motif以及基因芯片表达分析,并利用qRT-PCR技术分析该家族基因在400 mmol·L~(-1) NaCl、100 mmol·L~(-1) ABA和10%PEG逆境下的表达情况。结果表明,该转录因子家族在葡萄基因组中总共有27个成员,分布于11条染色体上,其中有10个成员集中分布在第14号和17号染色体上;氨基酸残基为175～880个,大多数具有疏水性。亚细胞定位分析表明,该基因家族主要存在于细胞核中。结构域分析显示,同一亚家族蛋白保守域结构高度相似。基因芯片表达结果显示,非生物胁迫下,叶片中VvTrihelix6在PEG处理24 h后与对照相比呈显著上调趋势,当用NaCl处理4h和24h后,与叶片对照相比有下调表达趋势;用ABA处理果实3d后,该基因在果实中呈下调表达,处理10d后变化不明显。叶片中VvTrihelix19转录因子经PEG、NaCl和冷胁迫处理24 h后明显下调;果实用ABA处理3 d和10 d后均有明显下调趋势。qRT-PCR分析表明该转录因子家族所有基因对逆境胁迫具有响应作用,但是,不同成员在不同逆境胁迫下的响应程度存在一定的差异。转录因子VvTrihelix6在400 mmol·L~(-1) NaCl和100 mmol·L~(-1) ABA处理下表达量极显著高于对照,分别是对照的15倍和8倍;VvTrihelix19只在10%PEG胁迫处理后呈显著上调表达。     

西瓜ClWRKY54基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY转录因子是植物中所特有的一类转录因子,以基因家族形式存在,并在植物的生长发育和逆境响应等过程中发挥重要的作用。采用RT-PCR的方法从西瓜中分离得到一条西瓜CIRKY54基因。序列分析表明,该基因开放阅读框全长1 428 bp,编码475个氨基酸。其编码蛋白分子量约为51.82 KD,等电点为6.17。该基因蛋白序列中包含2个WRKY保守结构域,锌指结构为C2H2型,属于典型的1类WRKY基因。进化树分析显示,该基因蛋白序列同葫芦科作物中的甜瓜、黄瓜、西葫芦等的WRKY26具有较高的同源性,处于同一分支上。亚细胞定位分析显示,该基因编码蛋白定位于细胞核中。对该基因进行荧光定量PCR分析研究其表达特性,结果显示该基因在西瓜根、茎、叶中均有表达,但是在叶片中表达量最高;H_2O_2可以诱导该基因的表达,而乙烯处理可以抑制该基因的表达,这说明该基因可能参与逆境下H_2O_2和乙烯所介导的信号途径。在模拟干旱下,该基因表达无变化,说明该基因同干旱胁迫抗性不相关。本研究的结果将为进一步的解析ClWRKY54的功能奠定基础。     

苹果WRKY转录因子家族基因生物信息学分析

 利用生物信息学方法对苹果MdWRKY转录因子家族成员、基因分类、染色体定位、系统进化关系和结构域序列保守性进行了预测,并分析基因在果实成熟期和砧穗互作中的表达差异。苹果MdWRKY家族包含116个基因,分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ,其中GroupⅡ又可细分为GroupⅡa、GroupⅡb、GroupⅡc、GroupⅡd和GroupⅡe亚类;苹果的17条染色体均有WRKY转录因子分布,其中第1条染色体上的分布最多,有12个WRKY基因分布。MdWRKY编码的蛋白在118 ~ 965个氨基酸范围内,等电点位于4.81 ~ 10.16之间。Microarray分析发现,在苹果果实成熟时期和砧木接穗互作过程中,多数MdWRKY基因的表达都有不同程度的变化。     

调控黄瓜苦味基因Bi的AP2/ERF家族转录因子

从华北型黄瓜‘9930’中克隆了黄瓜苦味形成的关键基因Bi的启动子序列,通过酵母单杂交技术对黄瓜叶片cDNA文库进行筛选,寻找可以调控Bi表达的转录因子。通过对筛选结果的测序及比对,发现有7种转录因子重复出现,包括2个AP2/ERF家族、3个bZIP家族、1个WRKY家族转录因子和1个E3泛素类COP1蛋白。其中AP2/ERF家族转录因子CsERF（登录号：Csa7M448110）重复出现6次,出现概率高于其他转录因子。利用烟草瞬时表达系统,CsERF对Bi启动子的结合及激活作用得到了进一步验证。初步证明CsERF可以结合到Bi的启动子并激活其转录,推测其很可能就是黄瓜叶片中调控苦味形成的关键转录因子。     

不同温度对菜心贮藏品质的影响

菜心外表嫩绿,水分含量大,茎、叶等组织脆弱,在贮藏期间极易出现叶片黄化掉落、萎焉等现象,目前菜心多因采后保护措施不到位,导致营养、口感等变差。菜心的贮藏品质与环境因素有关,其中温度是最主要的影响因素。为了解不同温度对菜心贮藏品质的影响,提高贮藏性,延长货架期,本试验研究了菜心在5个不同贮藏温度下营养品质的变化情况。结果表明,常温25℃不利于菜心的贮藏,菜心叶片的含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和维生素C含量迅速下降,与其他温度差异显著;而5℃对菜心有较好的保鲜效果,可减少水分散失,有效延缓叶绿素降解速率,抑制硝酸盐积累,使菜心保持较好的外观品质及较高的营养价值。     

大白菜抽薹过程叶色转变前后的生理变化

大白菜通过春化后至抽薹,叶色由绿变灰,这一叶色转变过程在弱冬性品系上的表现尤为突出。本试验以不同冬性的大白菜品系为材料,从激素、色素含量变化和蛋白质组分变化等方面研究大白菜抽薹过程叶色转变前后的生理变化。结果表明：激素、色素含量和蛋白质的变化均与叶色转变有一定关系,叶绿素a/b、IAA和GA3含量均在叶色转变期出现峰值。     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

菜薹抽薹相关基因BrcuDFR-like/BrcuAXS 的克隆与表达特性分析

 为了预测抽薹相关基因BrcuDFR-like/BrcuAXS 的功能,通过PCR 和RACE 的方法克隆了菜薹BrcuDFR-like/BrcuAXS 基因的cDNA 和gDNA 全长序列。结果表明：该基因编码区全长1 332 bp,编码312 个氨基酸残基。对应的gDNA 全长为2 460 bp,含有8 个外显子和7 个内含子,内含子总长为1 042bp,其中第3 个内含子最长,为401 bp。内含子中含有多个基本转录元件和顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素响应元件、参与抗性和胁迫应答元件、热响应元件、WRKY 转录因子的结合位点及干旱胁迫元件MYB 转录因子结合位点等。利用半定量RT-PCR 分析表达模式,发现BrcuDFR-like/BrcuAXS 随菜薹花芽形态逐步建成直至抽薹开花,其表达量逐渐增强,与其它物种DFR-like 基因的表达模式更吻合,由此预测该基因在菜薹生长发育阶段编码DFR-like 酶的可能性大于编码AXS 的可能性,其功能可能与菜薹营养分生组织向花分生组织转变有关。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）为材料，利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明，该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体，并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现，GUS染色主要集中于叶片，而在根、茎、花中染色较浅。此外，不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性，缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性，而分别供0.25 mmol ? L-1 NO3-、NH4+和NH4NO3的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明，BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。     

大神农叶面肥对菜心产量及品质的影响

探讨了大神农叶面肥对菜心产量及品质的影响。试验结果表明,大神农叶面肥在菜心上应用有显著增产和改善商品外观性状的作用,其中以大神农叶面肥500～1000倍液应用效果较好。     

菜薹(菜心)亲本材料的创制及新品种18A1菜心的选育

为了拓宽菜薹(菜心)种质资源,筛选优良亲本材料,进而选育菜心雄性不育系杂交种,本试验利用菜心与大白菜亚种间杂交、菜心与芥菜种间杂交及自然突变体筛选等3种途径,创制和鉴定优良的菜心育种材料,并广泛转育菜心CMS96细胞质不育系和配制CMS96细胞质不育系组合。结果表明,菜心与大白菜杂交、菜心与芥菜杂交及自然突变体筛选等方法是创制菜心种质资源的有效途径。利用亚种间杂交,获得菜心CMS96细胞质不育系、菜心瓣化型萝卜胞质Ogu CMS,叶片深紫色菜心,叶片塌地菜心;利用种间杂交,获得圆叶锯齿菜心,叶色翠绿菜心和叶片浅紫色菜心;基于自然突变,筛选到橘红色花菜心,乳白色花菜心和隐性核雄性不育系突变体。同时,以菜心细胞质不育系CMS96.农家菜心8与新西兰50天自交系杂交,成功选育出菜心新品种18A1菜心,中熟,叶色深绿,菜薹油绿,臺质脆嫩,口感好,适合广州等南方地区秋冬季和菜场基地种植。     

不同基因型大白菜对外源钙敏感性鉴定评价

为探讨大白菜钙敏感性鉴定的便捷指标,以20个大白菜品种为试材,研究不同钙水平对大白菜不同生育期干烧心指数及植株生长量、叶片叶绿素含量及钙含量的影响。结果表明:不同基因型大白菜干烧心指数差异较大,总体上均随钙水平的升高明显降低,而相同钙水平下则随生育期延长而升高;幼苗期钙水平0 mmol·L~(-1)和莲座期、结球期钙水平0.5mmol·L~(-1)处理的干烧心指数聚类结果基本一致。采用多元逐步回归分析建立的幼苗干烧心指数回归模型中,仅幼苗期0.5mmol·L~(-1)与4.0 mmol·L~(-1)钙水平下的植株鲜质量及叶片叶绿素含量相对值入选,且以入选变量为参数进行聚类分析的结果与幼苗期干烧心指数聚类结果完全一致,均可将参试大白菜品种分成钙敏感型、钙迟钝型和中间型3类,说明幼苗期0.5mmol·L~(-1)和4.0 mmol·L~(-1)钙水平下的大白菜植株鲜质量与叶片叶绿素含量相对值可作为大白菜品种钙敏感性鉴定的便捷指标。     

ABA和乙烯利处理下番茄的生理反应和Nr基因的表达

 为了探讨乙烯受体蛋白Nr基因与植株抗逆性的关系，研究了乙烯利和ABA处理下的番茄植 株代谢反应。研究结果表明：ABA处理诱导了Nr基因的大量表达，并被乙烯抑制剂Ag 所抑制；ABA还 能促进黄化苗的乙烯三重反应，并使呼吸作用降低，植株黄化。50~mol／L的乙烯利处理未能诱导Nr基因 的表达，虽有蒸腾作用和气孔导度的增加，但呼吸作用和细胞间cO 浓度无明显变化，植株生长正常。因 此，Nr基因的大量表达是由于ABA等环境胁迫诱导了内源乙烯的大量合成，是导致植物黄化和衰老的主 要原因之一。