甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析

应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

草地螟中肠肉碱-脂酰肉碱转位酶基因(LstiSLC25)的克隆及表达

利用甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜多克隆抗体免疫筛选草螟(Loxostege sticticalis)中肠cDNA表达文库,得到编码肉碱-脂酰肉碱转位酶(LstiSLC25)基因的全长cDNA克隆.该cDNA克隆全长1 474 bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1 kD和9.46.序列含有3个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征.将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli获得了表达.     

小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。     

白菜类富含亮氨酸重复（LRR）抗病蛋白基因BcLRR cDNA克隆及其介导的植物软腐病抗性分析

利用前期构建的软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株BC1侵染诱导表达的大白莱(Brassica campestris subsp.pekinensis)SSH cDNA文库和cDNA芯片.在芯片分析的基础上,选取一个与拟南芥(Arabidopsis thaliana)类富含亮氨酸重复(LRR)抗病蛋白Cf-5高度同源的EST序列(GenBank登录号:DN962361)进行进一步分析.用5'-和3'-RACE方法克隆了该基因全长1 286 bp的cDNA序列,包含一个完整ORF和3'UTR,并具有Poly(A)加尾信号,将其命名为BcLRR基因(GenBank登录号:EU424347).BcLRR推导蛋白序列由327个氨基酸组成,除N端跨膜螺旋结构域外,大部分为LRR结构域,包含8个胞外LRR重复单元,由7个规范的LXXLXLXN结构和1个不规范LXXLXXXN组成.氨基酸序列比对分析发现,BeLRR蛋白与拟南芥类LRR抗病蛋白Cf-5同源性高达96.6%,与棉花(Gossypium hirsutum L.)类LRR抗病蛋白GhLRR同源性为82.3%,它们之间大部分变异限定在N端信号肽区.系统发育关系表明,在三种植物中功能均未知的这一蛋白属于一个新的胞外LRR蛋白类型,在结构上不同于其它抗性已知的胞外型LRR蛋白.将受CaMV 35S启动子驱动的BcLRR基因完整ORF序列转化拟南芥Col-0,PCR鉴定、Southern杂交和RT-PCR分析表明,BcLRR基因已整合到拟南芥基因组中,并在拟南芥中获得了转录.软腐病病情指数分析表明,转BcLRR植株提高了对软腐欧文氏菌的抗性.     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达.     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

猪多潜能性维持因子5 cDNA全序列的克隆与分析

利用前期筛选出的一些与母猪妊娠相关的有价值的新候选基因,选取其中一个位于网络顶端的EST序列(CK455976),根据此EST序列设计引物,以母猪卵巢为材料提取总RNA,运用RT-PCR和RACE-PCR对其进行cDNA全序列克隆,得到多潜能性维持因子5(developmental pluripotency associated 5,DPPA5)基因cDNA全长596 bp,提交GenBank数据库,登录号为FJ436413.经序列分析发现,其中5'UTR长67 bp,3'UTR长175 bp,编码区长354 bp,编码117个氨基酸.同源性比对分析发现,该基因核苷酸序列与人、小鼠、猕猴和狗的DPPA5基因同源性分别为83%、70%、83%和80%;编码的氨基酸序列同源性分别为74%、55%、74%和69%.经生物信息学分析,预测出DPPA5的相对分子量约13.60 kD,等电点5.24,在约1～10、18～29、38～51、60～66和75～110位之间氨基酸存在亲水性区域,DPPA5蛋白主要存在于细胞膜外侧.     

草莓半胱氨酸蛋白酶基因(FaCP)的克隆及表达分析

半胱氨酸蛋白酶作为一种重要的水解蛋白酶,参与植物的许多生理过程.采用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria×ananassa)中克隆到半胱氨酸蛋白酶基因FaCP (GenBank登录号:JN979371),该基因cDNA全长1 338 bp,包含一个1 062 bp完整的开放阅读框(ORF),编码354氨基酸.生物信息学序列分析表明,FaCP开放阅读框编码的氨基酸序列与其他植物的CP蛋白同源性较高.Real-time PCR分析发现,FaCP基因在草莓果实、叶、根、茎和花萼中都有表达;在果实成熟过程中FaCP表达量逐渐增加,在粉红果最高,红果中略有下降.在草莓叶片中,随着叶片衰老,FaCP基因表达量增加明显.研究结果表明,FaCP可能参与了调控草莓果实的成熟及叶片衰老.     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。     

陆地棉GhLipase基因的克隆、特征分析及定位

利用已构建陆地棉7235纤维cDNA文库测序, 结合5′RACE技术从陆地棉 (Gossypium hirsutum L) 7235纤维中获得了1个1 286 bp的cDNA。序列分析结果表明, 该cDNA 包含一个编码368个氨基酸的开放读码框, 5′非翻译区和一个带有Poly (A) 的3′非翻译区区域。与已报道的其它植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性, 命名为GhLipase,提交到GenBank, 登录号为EU273298。RT-PCR分析表明, GhLipase在棉花的胚珠及纤维细胞中优势表达。Southern blot分析结果表明, GhLipase在陆地棉基因组可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

西农萨能羊47kD尾部相互作用蛋白基因(TIP47)的cDNA克隆、序列结构分析与组织表达

47kD尾部相互作用蛋白基因(tail-interacting protein47,TIP47)是影响脂滴形成和代谢的重要基因。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)的乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR和RACE,克隆了山羊TIP47基因的cDNA全长序列。结果得到TIP47基因cDNA序列全长1906bp(GenBank收录号为:HQ846827),包括5'UTR82bp,完整编码区1314bp及3'UTR510bp,编码蛋白质的氨基酸数为437,分子量47.36kD,等电点(pI)5.14。对TIP47基因的核苷酸和氨基酸序列分析发现,山羊的TIP47与GenBank中牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和猪(Sus scrofa)的TIP47相似性较高。蛋白质结构分析显示,TIP47不存在信号肽序列和跨膜结构;疏水性分析发现,其N端疏水性较强,中间靠近C端部分亲水性较强;三级结构分析发现,其C端呈大写的L形;该基因的遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪和人。通过RT-qPCR技术对TIP47基因进行了组织表达分析,发现所检测...     

巴西橡胶树K~＋通道蛋白基因HbKCO1的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术,成功地克隆了一个新的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因并分析了其结构和表达特征.结果表明,该基因cDNA全长1482 bp,拥有1059 bp的开放阅读框(ORE),编码353个氨基酸残基.同源性和聚类分析证实,该基因属于植物KCO家族,命名为HbKCO1(GenBank登录号为EU827609).半定量RT-PCR分析结果显示,HbKCOl在巴西橡胶树不同器官中均有表达,但叶片中表达量最高,茎次之,根、胶乳和树皮中的表达量最低;高钾、盐胁迫(NaC1)和Ca~(2+)可以促进叶片中HbKCOl的表达,钾饥饿和ABA则起到抑制作用;胶乳中HbKCOl的表达几乎不受乙烯利(ET)和茉莉酸(JA)的影响.     

毛竹液泡膜Na+/H+逆向运输蛋白基因克隆及表达分析

植物Na+/H+逆向转运蛋白具有稳定细胞质内Na+浓度和调节pH值的功能,对植物的耐盐性具有重要的作用。利用RT-PCR和RACE技术分离出毛竹(Phyllostachys pubescens)Na+/H+逆向转运蛋白编码基因PpNHX1的cDNA序列,全长2290bp(GenBank登录号为GU295174)。该基因的编码蛋白PpNHX1包含545个氨基酸残基,进行BLASTp比对,发现其与芦苇(Phragmites communis)PcNHX1、水稻(Oryza sativa)OsNHX1的序列同源性分别为89%和88%。系统发育分析表明,PpNHX1蛋白与禾本科植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。以半定量RT-PCR检测PpNHX1基因的表达情况,发现PpNHX1受到200mmol/L NaCl胁迫的诱导,在4h内的表达量随NaCl处理时间延长持续增强,其中根部的表达增强幅度明显高于茎和叶;但4h后,PpNHX1在根与叶中的表达量均有所下降。推断PpNHX1基因在盐胁迫下的表达调控与毛竹耐盐能力密切相关。