萝卜硫苷生物合成相关基因RsFMO_(GS-OXs)的预测及分析

以控制拟南芥硫苷生物合成相关基因家族FMO GS-OXs全长cds为参考序列,在萝卜ESTs数据库中进行blastn检索,得到具备Score≥100、E-value≤10-10和coverage≥70%条件的24条萝卜ESTs作为候选的拟南芥FMO GS-OXs基因的同源ESTs,并进行序列聚类拼接、注释及分析。结果显示:在萝卜中发现两个旁系同源基因(RsFMO GS-OXa和RsFMO GS-OXb)。RsFMO GS-OXs与拟南芥FMO GS-OXs间在核酸水平上的一致性为68.0%⁸3.2%;RsFMO GS-OXs旁系同源基因间的一致性仅为67.3%;RsFMO GS-OXs与白菜FMO GS-OXs同源基因间的一致性为67.3%83.2%;RsFMO GS-OXs旁系同源基因间的一致性仅为67.3%;RsFMO GS-OXs与白菜FMO GS-OXs同源基因间的一致性为67.3%⁹2.9%。系统进化分析发现,RsFMO GS-OXa和白菜FMO GS-OX2基因亲缘关系最近,而RsFMO GS-OXb和白菜FMO GS-OX5a亲缘关系更近一些,同时认为,RsFMO GS-OXa和RsFMO GS-OXb的直系同源基因分别为FMO GS-OX2和FMO GS-OX5。     

萝卜属抽薹开花相关基因FLC的预测及分析

以控制拟南芥春化途径的关键基因FLC全长CDS为参考序列,在萝卜属(Raphanus) EST数据库中进行BLASTN检索,得到具备Score≥100、E value≤10-10和coverage ≥70%条件的70条萝卜ESTs作为候选的拟南芥FLC基因的同源ESTs,并进行序列聚类拼接、注释及分析。结果显示: 在普通萝卜和野生萝卜中各发现两个旁系同源基因(RsFLCa和RsFLCb及RrFLCa和RrFLCb)。RFLCs与拟南芥FLC间在核酸水平上的一致性为787%～869%;RFLCs旁系同源基因间的一致性为759%～934%;RFLCs与芸薹属FLC直系同源基因间的一致性绝大多数维持在85%以上,且高于与拟南芥直系同源基因间的一致性。系统进化分析发现,与白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中FLC多拷贝产生的机制可能类似,萝卜属FLC基因的多拷贝现象可能也是伴随萝卜基因组的多倍化而产生的。     

甘蓝硫苷生物合成相关基因FMO_(GS-OXS)的预测与分析

以拟南芥中控制硫苷生物合成相关基因家族FMO_(GS-OX)位点基因全长编码区及蛋白为参考序列,在甘蓝(Brassica oleraceae L.)基因组数据库中进行Blastn和Blastp检索,得到具备Score≥100、E值≤10-10、coverage≥70%条件的甘蓝注释基因作为候选拟南芥FMO_(GS-OX)的同源基因,并进一步进行同源性比较、基因结构比较及序列聚类分析。结果显示,在甘蓝中发现3个旁系同源基因Bol010993、Bol029100、Bol031350。甘蓝和拟南芥FMO_(GS-OX)同源基因之间在核酸水平上的相似性为69.4%~83.0%;甘蓝3个FMO_(GS-OX)旁系同源基因间的相似性保持在70.0%~84.0%。甘蓝Bol010993与拟南芥FMO_(GS-OX)1~FMO_(GS-OX)4的结构较为相似,而Bol029100、Bol031350与拟南芥FMO_(GS-OX)5的结构较相似。系统进化分析及共线性分析初步确定,甘蓝中分别存在1个FMO_(GS-OX)2(Bol010993)和2个FMO_(GS-OX)5(Bol029100、Bol031350)基因。     

甘蓝GS-Elong位点基因的预测与分析

以拟南芥中控制硫苷生物合成相关基因家族GS-Elong的全长CDS及蛋白序列为参考序列,在甘蓝(Brassica oleracea L.)基因组数据库中进行BLASTN和BLASTP检索,得到具备Score≥100、E-value≤10-10和Coverage≥70%条件的甘蓝注释基因作为拟南芥GS-Elong位点基因的候选同源基因,并进一步对其进行同源性和基因结构比较及聚类分析。结果显示,在甘蓝GS-Elong位点发现4个旁系同源基因(Bol020647、Bol017070、Bol037823和Bol017071)。甘蓝和拟南芥GS-Elong位点同源基因在核酸水平上的一致性为66.1%~84.3%;甘蓝4个旁系同源基因间的一致性在62.0%~83.7%之间。甘蓝和拟南芥GSElong位点基因在外显子数目、大小方面高度一致,但Bol017071和Bol037823分别较拟南芥GS-Elong位点基因少3个和1个外显子。系统进化及共线性分析初步确定,甘蓝中存在2个BoMAM1(Bol017070和Bol020647)和2个Bo MAM3(Bol017071和Bol037823)。     

十字花科植物HSP22基因同源序列的克隆与进化分析

采用PCR克隆技术,根据已报道的拟南芥的AtHSP22基因全长及其他物种同源序列设计特异引物,在十字花科植物大白菜、普通白菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜、花椰菜、芥菜、荠菜、萝卜3个属10个物种中成功克隆得到耐热相关基因HSP22的同源序列10条。序列比对分析表明:这些同源序列的相似性达89.3%以上,所推导的氨基酸序列相似性达92.1%以上。由进化树可直观地看出,芸薹属与荠属亲缘关系最近,首先聚为一类;其次与萝卜属、拟南芥属聚为一类。由氨基酸序列预测的高级结构存在明显差异,且无规则卷曲最多,α-螺旋均在30%以上,因而属于α结构蛋白。     

萝卜抽薹开花相关基因的研究进展

通过构建萝卜抽薹开花相关基因的cDNA文库,获取大量的EST序列,并与十字花科模式植物拟南芥、白菜等进行比较基因组学研究,研究结果显示:萝卜与拟南芥、白菜等植物基因组具有很高的同源性,控制抽薹开花的相关基因在不同物种中具有保守性。拟南芥抽薹研究表明,抽薹开花过程受多基因控制,具有多种调控途径。抽薹开花是一个复杂的过程,其中FLC、FT、LFY等基因处于关键位置。目前这些关键基因在萝卜EST序列中已经发现了同源片段,并进行了一些基因克隆,结合萝卜基因组测序的完成,未来萝卜抽薹研究将进入基因功能验证和全基因组调控模式研究之中。     

甘蓝型油菜BnFAD2基因的生物信息学分析

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtFAD2为参考序列,通过BLAST进行同源序列比对,获得FAD2基因在甘蓝(Brassica oleracea)、白菜(Brassica rapa)和甘蓝型油菜(Brassica napus)基因组中的同源拷贝。运用生物信息学方法分析其氨基酸序列的组成、蛋白质基本理化性质、亚细胞定位、亲水性和疏水性、蛋白质二三级结构、保守结构域,并对FAD2基因编辑靶点进行预测及sgRNA设计。在白菜、甘蓝与甘蓝型油菜获得2条FAD2基因同源蛋白质序列;亚细胞定位显示这些AtFAD2同源蛋白质均位于内质网,肽链表现为疏水性、比较稳定;蛋白质序列二三级结构预测表明,主要以α-螺旋和无规则卷曲为组成成分;蛋白质序列保守结构域分析显示,FAD2具有高度的序列保守性,属于Membrane-FADS-like超家族,且含PLN02505保守结构域;系统进化树构建分析显示,甘蓝型油菜和白菜、甘蓝以及芥菜型油菜具有紧密的亲缘关系;CRISPR-Cas9基因编辑靶点分析发现,甘蓝型油菜FAD2基因中存在10段高度保守性序列可作为候选靶点,并设计出相应的sgRNA。     

番茄与西瓜中番茄红素生物合成途径基因的比较分析

为了阐明番茄和西瓜中番茄红素生物合成途径的相关基因,借助比较基因组学,在全基因组水平上对两物种间该代谢途径进行了比较分析。在番茄中共鉴定了12个番茄红素生物合成途径基因,在西瓜中发现了14个相应的番茄红素生物合成途径基因,同时将所有基因定位到相应的染色体上。番茄和西瓜中直系同源番茄红素生物合成基因在核酸水平保持在54.8%~75.0%的一致性,而西瓜中相应的旁系同源基因在核酸水平上的一致性为70.5%~74.8%。番茄与西瓜中番茄红素直系同源基因间在基因结构上高度相似。且系统进化分析发现西瓜中番茄红素生物合成关键基因PSY(Cla005425)和LCYE(Cla016840)可能与胡萝卜中的直系同源基因拥有共同的祖先。     

白菜硫代葡萄糖甙合成中MAM 的进化分析

【目的】探索硫代葡萄糖甙合成中关键基因-甲基硫代烷烃基苹果酸合成酶（methylthioalkylmalate,MAM）基因在白菜基因组中的进化情况,为研究白菜MAM的功能提供理论指导。【方法】根据白菜数据库BARD信息分析拟南芥、盐芥和白菜MAM的共线性关系,利用MEME在线软件预测MAM序列的高度保守基序（motif）,通过R软件分析93份白菜材料MAM的表达模式,并利用MEGA5.05软件构建MAM的系统进化树。【结果】白菜的3个亚基因组均保留着MAM的同源基因。其中与拟南芥具有共线性的5个同源基因可能源自基因组古三倍化复制,其它两个同源基因可能是由转座扩增产生的;基序分析结果表明,与拟南芥的MAM相比,白菜的MAM同源基因存在基序的缺失,并且大多发生在序列的两端;在93份白菜材料中,白菜MAM同源基因之间的表达量有很大差异,Bra021947与Bra018524只在少数材料中存在极低的表达,并且Bra029356的表达量低于可检测水平;进化树分析发现,除Bra018524外,其他的白菜MAM同源基因与拟南芥的MAM聚集在不同的分支上。【结论】白菜的MAM可能在拟南芥和白菜物种分化之后独立起源并进化出不同的功能。     

3种芸薹属植物ROH1基因的克隆及分析

[目的]通过PCR和RT-PCR技术从甘蓝、白菜和萝卜中扩增ROH1基因序列,分析该基因的基本特性。[方法]采用生物信息学的相关方法进行分析。[结果]甘蓝、白菜、萝卜ROH1基因没有内含子,甘蓝ROH1基因编码398个氨基酸,白菜和萝卜ROH1基因均编码400个氨基酸,3种植物的ROH1蛋白序列与拟南芥已经公布的ROH1(At1g63930)蛋白氨基酸缺少一段连续的氨基酸序列;ROH1属于DUF793蛋白超家族,它没有跨膜结构域和信号肽,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。同源比对及功能联想分析发现植物中ROH1非常保守,系统发育分析表明甘蓝、白菜和萝卜的关系最近;结构功能分析发现ROH1可能与BYPASS蛋白和AT4G11300蛋白的功能相似。[结论]为研究DUF793蛋白超家族功能提供参考。     

油菜N13和N18上含油量QTL作图区间相关候选基因克隆

以前人报道的SG-图谱和DH群体为材料,利用拟南芥脂质基因库和芸薹属EST库信息资源,选择与拟南芥中诠释的重要油脂合成相关基因高度同源的甘蓝型油菜EST和其他具有基因信息的EST序列为标记来源,发展功能基因标记加密SG图谱;对定位在N13和N18连锁群上含油量QTL区间的相关基因片段进行克隆、测序和生物信息学分析,以期获得可能与种子含油量QTL有关联的侯选基因。结果表明:在2条连锁群的3个含油量QTL区域内共连锁上6个功能基因,其中与拟南芥同源的3个基因在油脂合成途径中发挥重要作用;其双亲差异片段经克隆测序和比对分析,发现有2个在双亲间存在氨基酸水平差异;将获得的基因片段和拟南芥同源基因序列比对结果显示,二者间内含子部分核苷酸序列相似率平均为57.7%,外显子区域为86.7%,氨基酸水平上则达到89.2%。     

番茄与西瓜中番茄红素生物合成途径基因的比较分析

为了阐明番茄和西瓜中番茄红素生物合成途径的相关基因,借助比较基因组学,在全基因组水平上对两物种间该代谢途径进行了比较分析。在番茄中共鉴定了12个番茄红素生物合成途径基因,在西瓜中发现了14个相应的番茄红素生物合成途径基因,同时将所有基因定位到相应的染色体上。番茄和西瓜中直系同源番茄红素生物合成基因在核酸水平保持在54.8%⁷5.0%的一致性,而西瓜中相应的旁系同源基因在核酸水平上的一致性为70.5%75.0%的一致性,而西瓜中相应的旁系同源基因在核酸水平上的一致性为70.5%⁷4.8%。番茄与西瓜中番茄红素直系同源基因间在基因结构上高度相似。且系统进化分析发现西瓜中番茄红素生物合成关键基因PSY(Cla005425)和LCYE(Cla016840)可能与胡萝卜中的直系同源基因拥有共同的祖先。     

萝卜抽薹开花促进因子RsFPF1基因克隆与功能分析

采用电子克隆与基因组步移策略分离出萝卜RsFPF1基因gDNA和cDNA及启动子序列,并进行表达特征分析及转基因功能验证。序列分析表明,RsFPF1基因长度为330 bp,编码109个氨基酸;蛋白同源分析表明,RsFPF1蛋白与拟南芥及白芥FPF1蛋白间亲缘关系最近。RsFPF1基因5'上游启动子区序列长度为1 845 bp,采用PLACE和PlantCARE软件分析表明,该启动子序列含有典型调控元件及多个光响应顺式元件。半定量RT-PCR表达分析表明,开花前RsFPF1基因在茎尖表达量最高,开花后在花及花蕾中表达量最高。通过农杆菌介导的遗传转化获得转RsFPF1基因的烟草阳性植株,与野生型相比,转入RsFPF1基因的植株出现花期提前现象。结论:RsFPF1基因能够促进萝卜提早开花,其表达可能受光调控,在调控萝卜抽薹开花及花发生相关基因表达方面发挥着重要作用。     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

黑麦属NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物抗病基因(resistance gene,Rgene)编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计了10对特异简并引物,对5份黑麦材料的基因组DNA进行抗病基因同源序列克隆,共获得45条抗病基因同源序列(resistance geneanalogs,RGAs)。同源性比较发现,RGAs序列之间的核苷酸相似性是41.9%~99.6%,其中16条具有连续开放阅读框(ORFs)。同时,利用MEGA 3.1将这16条序列与4个已知R基因进行聚类分析,发现有13条序列与RPM1亲缘关系近,2条与Pm3a亲缘关系近。本研究在黑麦中获得的RGAs既可用于筛选黑麦的抗病候选基因,同时也可以作为分子标记,用于作物分子辅助选择育种,且对进一步研究黑麦中NBS-LRR类R基因的起源和遗传进化提供参考和依据。     

贵州芸薹黄化病毒的分子检测及基因型鉴定

【目的】对贵州省白菜、萝卜和甘蓝感染芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）进行分子检测及基因型鉴定,为马铃薯卷叶病毒属病毒的防治提供理论参考。【方法】在贵州省遵义市、威宁县、关岭县、平坝县等县（市）共采集284份蔬菜（白菜、萝卜和甘蓝）疑似病毒病样品,利用马铃薯卷叶病毒属的通用引物进行RT-PCR分子检测,并对检测出的16个BrYV分离物进行P0和CP基因序列扩增,再与已报道的BrYV基因序列进行比对,从而构建系统发育进化树,鉴定其基因型。【结果】284份疑似病毒病样品中,有43份样品检测出BrYV,检出率为15.14%,其中,感染BrYV白菜样品12份,占白菜总样品数的12.77%;感染BrYV萝卜样品14份,占萝卜总样品数的20.29%;感染BrYV甘蓝样品17份,占甘蓝总样品数的14.05%。贵州16个BrYV分离物P0基因核苷酸序列的相似性为89.9%~100.0%,CP基因核苷酸序列的相似性为93.5%~100.0%,二者编码的氨基酸序列相似性均为100.0%。基于P0基因构建的系统发育进化树可知,BrYV-Pingba-BC-2、BrYV-Zunyi-LB-1和BrYV-Zhijing-BC-1均与BrYV-BJS和BrYV-BBJ聚为一类,其余13个分离物均与BrYV-ABJ和BrYV-AJS聚为一类。基于CP基因构建的系统发育进化树可知,贵州不同地区不同蔬菜作物的16个BrYV分离与BrYV-A和BrYV-B基因型无明显分界,亲缘关系均较近。BrYV P0基因检测到5个重组事件,BrYV CP基因未检测到潜在重组事件。【结论】BrYV在贵州白菜、萝卜和甘蓝上普遍发生,但对萝卜的危害最重,主要存在BrYV-A和BrYV-B 2种基因型。     

芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。     

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

【目的】利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。【方法】根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物，对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。【结果】获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现，该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示，该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交，结果表明，其在基因组中存在多拷贝。【结论】本研究成功获得了不结球白菜RGA序列，为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。     

拟南芥和水稻cystatin基因家族的生物信息学分析

利用已经分离的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的cystatin结构域为检索序列在基因组水平上对拟南芥和水稻中的cystatin基因家族的成员进行分析;同时利用这些基因编码的蛋白质序列构建系统发生树,并对这些蛋白序列的保守序列进行分析;最后在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列。结果表明:1结合结构域的鉴定、多序列联配以及MEME分析最终确定了7个拟南芥和11个水稻的cystatin基因。2系统发生分析表明,cystatin基因的基本特征很可能是在拟南芥和水稻的分离之前就已经形成。3 cystatin结构域在蛋白质间高度保守。4拟南芥和水稻的cystatin基因主要在花、叶、根、种子和愈伤组织中表达,这有助于植物避免昆虫的侵害。     

大白菜中1个低温相关cDNA克隆序列分析

植物在冷驯化过程中会产生基因表达的变化.用RT-PCR和RACE技术相结合,从耐低温植物大白菜品种早熟5号中得到了1个cDNA克隆,经序列及功能分析,表明是个冷相关基因.由氨基酸序列推测它的分子质量大约为30u,故命名该基因为cor30.经数据库同源查找及序列比较,发现该基因的氨基酸序列与拟南芥基因COR47及ERD10分别具有59.4%和60.2%的同源性.