番茄斑萎病毒N基因的VIGS载体构建

 番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)严重危害多种经济作物和园艺植物,其N基因与病毒的侵染力密切相关,将N基因直接构建到VIGS载体上研究其致病功能目前鲜见报道。本研究将TSWV N基因构建到pTRV-PTV00载体上,注射本氏烟,通过qRT-PCR定量分析发现先接种TSWV后注射沉默载体的植株抗TSWV效率达57.60%,先注射沉默载体后接种TSWV的植株抗TSWV效率达99.14%。结果表明先注射载体后接种TSWV的N基因沉默效率更高。TSWV N基因VIGS载体的构建可为研究N基因在病毒致病等方面的功能提供前期材料,并为TSWV抗病育种和田间绿色防控提供一定的理论依据。     

番茄SlAGO1的表达分析及其抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)功能研究

 本研究运用 MEGA 7.0 进行多序列比对并构建系统进化树,利用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析SlAGO1在番茄组织中的表达水平及接种TYLCV后的防御响应;通过沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶基因SlPDS,建立‘矮番茄'沉默体系,采用 qRT-PCR 分析SlAGO1在沉默后对TYLCV表达的影响。系统进化树结果显示SlAGO1a/b(SlAGO1)氨基酸序列同源性极高,暗示其为同一个基因在染色体上的多个拷贝;qRT-PCR分析表明,SlAGO1在花、叶中显著表达,且受TYLCV的诱导表达;VIGS沉默SlAGO1后接种TYLCV侵染性克隆,植株表现出明显的病毒症状,qRT-PCR分析显示病毒含量显著高于对照,表明SlAGO1在番茄植株抗病毒中发挥重要作用。研究结果可为番茄抗病毒机制研究及番茄抗病毒育种奠定基础。     

病毒载体介导的基因沉默体系对朱顶红褪绿环斑病毒NSm基因的沉默效应

为探讨烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）载体介导的基因沉默技术对朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV）运动蛋白基因NSm的沉默效应,以本氏烟Nicotiana tabacum为材料,构建靶向HCRV NSm序列的基因沉默表达载体pTRV2-NSm,经农杆菌Agrobacterium介导侵染烟苗,检测其侵染效率,人工接种HCRV到沉默表达载体处理过的烟苗,通过观察发病症状、统计病情并应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测TRV介导的基因沉默体系对HCRV侵染的沉默效应。结果表明,pTRV2-NSm沉默表达载体对本氏烟植株的侵染率达到95.00%,并且对本氏烟的生长无明显影响;与对照相比,经沉默载体处理的烟草植株接种HCRV后发病率显著降低,在接种后14 d发病率下降了90个百分点,病毒积累量明显下降,随着时间延长pTRV2-NSm对病毒的抑制效果持续升高,在接种后14 d对病毒病的防治效果最高,达93.13%;qRT-PCR检测发...     

毒株、苗龄及温度对烟草苗期接种TMV试验的影响

 病毒株系、苗龄、接种后培养条件是影响烟草病毒病发生发展的关键因素,为确保烟草接种TMV抗性鉴定和药效生测试验的准确性,在N基因烟草和普通烟草上接种TMV,采用病毒生物学、qRT-PCR和Western blot技术,研究病毒的分离纯化、株系、稀释限点、传导路径、病害症状,以及N基因抗TMV的温敏性。结果显示,TMV为U1株系,在K326上活体保存50~65 d,仍具有较强的致病力,稀释限点为10⁵,接种物浓度以10²稀释为宜。接种后TMV先由接种叶传导到主茎,向下至根、向上至心叶,然后是上部叶,最后传导至下部叶,12~16 d布满全株,21~28 d花叶畸形显著,病情调查宜在2~3周内。温度和苗龄影响N基因烟草对TMV的抗性反应,培养温度应在25℃~27℃,苗龄以6~7叶期为宜。     

抗TSWV转基因烟草植株的初步研究

 番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,即TSWV)是一种寄生范围很广、世界性分布的植物病毒,能对多种作物(包括烟草)造成严重的危害。该项研究,是把TSWV的外壳蛋白基因转入烟草,获得了抗TSWV的转基因烟株,进一步检验其对TMV的抗性并检测其后代植株中的目的基因。     

内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

 有研究表明烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)侵染烟草能够激活转录因子NbNAC089,从ER膜移至细胞核。为进一步阐释内质网应激因子NbNAC089对病毒侵染胁迫的响应机制,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,经烟草遗传转染获得NbNAC089基因突变植株。植株接种病毒后采用qRT-PCR检测病毒CP基因和寄主UPR基因的表达。结果表明:CRISPR/Cas9系统定点敲除NbNAC089基因后,目的基因靶位点序列有碱基的置换与缺失。正常生长条件下,转基因植株与野生型无差异。植株接种TMV-GFP后24~96 h,突变体中UPR基因(BiP、bZIP28、bZIP60)的表达量显著高于野生型;接种TMV-GFP后2~6 d突变体中病毒的积累量和扩展速度显著高于野生型。表明NbNAC089为UPR的抑制因子,对病毒增殖具有负调控作用。     

转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究

 用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。     

侵染四川辣椒的番茄斑萎病毒和辣椒轻斑驳病毒的小RNA测序检测及鉴定

 调查发现四川省汶川县当地辣椒的病毒病严重且症状多样,病样粗提液摩擦接种辣椒、矮牵牛和三生烟,出现辣椒系统性花叶焦枯和茎尖坏死,指示植物表现局部枯斑。对3个不同症状的病果进行sRNA深度测序鉴定,发现均含有番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)。通过RT-PCR技术进行验证,结果显示所有病样的果皮和部分新鲜种子以及回接寄主的病叶均检测到TSWV和PMMoV,表明该地辣椒病毒病是由TSWV和PMMoV复合侵染引起。这是TSWV侵染四川辣椒的首次报道。分别基于TSWV N基因序列和PMMoV CP基因序列构建系统发育树,汶川分离物TSWV-WC(MK468469)与贵州分离物(KP684518)亲缘关系最近,PMMoV-WC(MK408614)与北京分离物(AY859497)亲缘关系最近。推测该地辣椒病毒病可能与品种引进有关。     

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

 根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。     

本氏烟NbWRKY40亚家族转录因子抗病相关功能研究

 植物WRKY类转录因子的IIa亚类广泛参与调控植物的生物胁迫和非生物胁迫过程。本研究根据拟南芥和普通烟中具有抗病和抗胁迫功能的IIa亚类WRKY40转录因子的序列,利用基因同源克隆法,获得本氏烟中NbWRKY40基因。序列分析表明在本氏烟中有5个属于IIa亚类的基因,其序列之间具有高度相似性。qRT-PCR检测发现NbWRKY40基因是受寄生疫霉侵染诱导上调表达的基因,通过VIGS技术研究该类基因在本氏烟中的抗病相关功能,用半活体营养型寄生疫霉进行抗病性试验,结果表明NbWRKY40基因的沉默降低了本氏烟对寄生疫霉的抗性,且在侵染点的细胞坏死程度增强,过氧化氢积累和胼胝质沉积都明显减少。NbWRKY40基因沉默同样降低了本氏烟对死体营养型灰霉菌的抗性。检测NbWRKY40基因沉默后4个不同抗病信号通路下游基因的表达,发现基因沉默导致参与抗病和SA途径的PR1b、PR2b基因受疫霉侵染诱导表达的水平明显下降。综上,推测NbWRKY40基因可能依靠SA介导的信号通路参与调控本氏烟抗病性。     

草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建

 利用草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)全长克隆pSVBV-E3构建SVBV侵染性克隆。pSVBV-E3经限制性内切酶酶切分别获得0.5-mer SVBV和1.0-mer SVBV,依次正向插入植物表达载体pBINPLUS,成功构建侵染性克隆重组质粒pBIN-1.5SVBV。pBIN-1.5SVBV转化农杆菌,分别接种森林草莓(Fragaria vesca)和4种烟草属植物(Nico-tiana spp.)验证其侵染性。结果表明,SVBV侵染性克隆接种森林草莓8周后发病,表现出典型的叶脉镶边黄化症状,PCR法可以从显症森林草莓中检测出SVBV cp基因,Southern blot法可以检测出SVBV基因组。而接种4种烟草属植物8周后未观察到发病症状,PCR法也未检测出SVBV cp基因。构建的SVBV侵染性克隆经接种验证能够侵染森林草莓,为进一步研究SVBV侵染森林草莓的致病机制奠定了基础。     

侵染广西甜椒的西瓜银斑驳病毒分子鉴定

During a survey in 2019, sweet pepper plants (GXTJ) showing symptoms of ring spots and chlorotic on leaves and fruits were collected in Wuming district of Guangxi province. Serological tests by DAS-ELISA demonstrated that the GXTJ was reacted positively against to antisera of watermelon silver mottle virus (WSMoV), but negatively against to antisera of the tomato spotted wilt virus (TSWV), cucumber mosaic virus (CMV) and tobacco mosaic virus (TMV). Total RNA was extracted and 2 pairs specific primers were designed to amplify the WSMoV N gene sequence by RT-PCR. Two expected fragments (769 bp and 654 bp) were obtained from GXTJ, The results of sequence analysis showed that the sequence of N gene was 828 nt and sharing 100% identity with WSMoV isolates from Taiwan (X78556, U78734). Base on the phylogenetic analysis, the N gene sequence of WSMoV-GXTJ was grouped in the same clades as WSMoV isolates from Taiwan. These results indicate that the virus isolate from sweet pepper in Guangxi is an isolate of WSMoV.     

含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的构建

 本研究用来自烟草的具有高度病原物特异性的两个诱导启动子EAS4和hsr203J,串联驱动GUS基因的表达,同时考虑到转基因植物的安全性,引入双边界序列,构建了含双病原物诱导启动子的植物安全表达载体。将表达载体转化烟草获得转基因植株。分析显示,在正常生长情况下转基因烟草检测不到GUS活性,或活性极低;而受疫霉激发子parasiticein、Phytophthora nicotianea[0]的孢子悬浮液和Ralstonia solanacarum的菌悬液诱导后,转基因烟草叶片中可检测到明显的GUS活性。结果表明,构建的植物表达载体所含双病原物诱导启动子均具有良好的诱导活性,可用于植物遗传转化。     

香豆素合成途径关键酶基因Ghpal、Ghc4h和Gh4cl在棉花抗链格孢菌中的作用

链格孢菌Alternaria alternata引起的棉花轮纹斑病,是导致棉花早衰发生的主要成因之一,严重危害棉花生产。香豆素合成途径作为合成植保素的一条代谢支路,其产物能够抑制病原菌,增强植物的抗病性。为了揭示该途径在棉花抗链格孢菌中的作用,本文利用棉花皱缩病毒介导的基因沉默技术,通过对棉花香豆素合成途径中编码关键酶基因的沉默抑制,来解析其在棉花抗链格孢菌中的作用,所选择的基因有编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因Ghpal、肉桂-4-羟化酶(C4H)基因Ghc4h和4香豆酸-辅酶-A(4CL)的基因Gh4cl。结果显示,Ghpal、Ghc4h和Gh4cl基因受链格孢菌诱导转录,表明这些基因可能参与了棉花对链格孢菌的抗性反应。Ghpal、Ghc4h和Gh4cl基因分别被沉默后,结果显示各基因沉默植株对链格孢菌的抗性下降,表现为接种链格孢菌后,基因沉默植株的病情指数分别为43.36、38.27和44.78,显著高于野生型和VIGS空载体对照植株。这表明,Ghpal、Ghc4h和Gh4cl参与了棉花对链格孢菌的抗性反应。此外,离体条件下给Ghpal、Ghc4h和Gh4cl基因沉默植株叶片饲喂外源香豆素,结果发现基因沉默植株对链格孢菌的抗性得到恢复。这一结果进一步表明香豆素合成途径在棉花抗链格孢菌中起着重要作用。     

重组黄瓜花叶病毒2b基因PVX侵染性载体的稳定性分析

 本研究利用北京甘蓝CMV分离物(CMV-BG)全长2b基因,构建了含其正义和反义序列的PVX侵染性载体pVX2bS和pVX2bAS,并进行了它们与PVX侵染性载体间的共侵染稳定性实验。结果表明:pVX2bS和pVX2bAS能侵染本氏烟、SR1、Sam sun NN烟草、Shepody马铃薯和中蔬5号番茄,与pSfinx相比,表现不同程度的症状延迟效应;pVX2bS和pVX2bAS在22℃/16℃(昼/夜温度)条件下,接种SR1烟草45d仍可检测到重组载体的存在;pVX2bS和pVX2bAS菌液混合接种15d后只能检测到正义或反义一种载体的随机表达,二者交互接种,后接种的一方不能表达。     

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

 为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。     

辣椒CaRKNIF2基因的诱导表达特征及RNAi效应分析

[目的]明确在多种植物病原物和植物激素处理下,辣椒CaRKNIF2基因的诱导表达特性,分析CaRKNIF2基因的抗根结线虫功能.[方法]以辣椒‘HDA149’为试材,分别接种南方根结线虫毒性群体、烟草花叶病毒(TMV)、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信号分子水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA),实时荧光定量PCR分析了辣椒CaRKNIF2基因的诱导表达模式和特征;构建了含CaRKNIF2基因片段的RNAi载体,通过烟草脆裂病毒介导的基因沉默(VIGS)同源沉默辣椒CaRKNIF2基因,来评价CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株对线虫侵染的应答效应.[结果]信号分子MeJA抑制CaRKNIF2的表达,但TMV、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信号分子水杨酸(SA)能快速而显著地诱导CaRKNIF2的表达,而毒性南方根结线虫对CaRKNIF2的表达则基本无影响;CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株接种非毒性南方根结线虫后根部卵块数明显增加.[结论]这些结果为进一步解析CaRKNIF2的调控功能提供了重要的证据.