NaCl胁迫对留兰香基因组DNA及其甲基化的影响

盐胁迫制约农业生产的因素之一。本研究以留兰香为材料,对氯化钠处理对留兰香生长发育和生理生化反应的影响,以及基因组DNA的甲基化水平和模式进行了研究。结果表明,氯化钠处理20天后,随着盐浓度的升高,叶绿素的含量逐渐降低,MDA和脯氨酸含量逐渐增大。AFLP分析表明,处理组与对照组之间未发现特异片段,基因组序列未发生变异。MSAP分析表明,50mmol/LNaCl 处理会引起全基因组DNA的甲基化水平降低,而100和150mmol/L NaCl则诱导了全基因组DNA的甲基化水平升高;与对照相比,50、100和150 mmol/L NaCl处理后DNA甲基化和去甲基化比率分别为4.35%、9.93%、12.46%和12.73%、13.12%、20.54%。     

转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150 mmol L^-1 NaCl和150 mmol L^-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.6倍和1.62倍;150、250 mmol L^-1甘露醇和150 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。     

逆境处理下水稻叶角质层蜡质积累及其与蜡质合成相关基因OsGL1表达的关系

植物角质层蜡质在抵抗各种生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用。本试验以水稻(Oryza sativa L.)幼苗为材料, 分别以200 mmol L^-1 NaCl、12% PEG、1.0% H₂O₂、40℃高温和8℃低温为逆境, 研究叶角质层蜡质的积累情况以及其与水稻蜡质合成相关基因OsGL1表达的关系。扫描电镜观察以及叶角质层蜡质总量测定结果表明, 12% PEG、1.0% H₂O₂和8℃低温处理下水稻幼苗叶角质层蜡质的积累明显增加, 而200 mmol L^-1 NaCl和40℃高温处理下叶角质层蜡质覆盖量略有下降。RT-PCR分析显示, 逆境处理下水稻蜡质合成相关基因OsGL1的表达量变化与水稻幼苗叶角质层蜡质的积累存在相关性。     

水盐浸种对NaCl胁迫下向日葵幼苗渗透调节物质的影响

以向日葵为材料,分别以水、400mmol/L NaCl浸种,评估二者对NaCl胁迫条件下(150mmol/L NaCl)向日葵幼苗中渗透调节物质积累的影响。结果表明:与对照相比,NaCl胁迫导致向日葵叶片、茎部脯氨酸(Pro)含量分别增加了3.36倍、2.40倍;经水、盐浸种后,向日葵叶片中Pro含量分别增加了6.19倍、4.72倍,茎部Pro含量差异不显著。与对照相比,NaCl胁迫处理不同程度地减少了向日葵叶片、茎、根中K⁺含量,增加Na⁺的吸收,K⁺:Na⁺明显降低;在NaCl胁迫条件下,水浸种、盐浸种不同程度地影响了幼苗中K⁺、Na⁺的含量、分配,但是经LSD比较,三种处理中离子含量没有明显差异。由此可见,在150mmol/LNaCl胁迫条件下,水、盐浸种更有效地诱导向日葵中Pro的积累来参与渗透调节。     

青枯菌诱导下花生基因组DNA表观遗传变化的MSAP分析

以高感青枯病品种中花12号和高抗青枯病品种远杂9102为材料,调查青枯菌接种12 h后花生基因组DNA的甲基化水平和变化模式。甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)分析表明,正常生长的中花12号和远杂9102的基因组DNA甲基化比率均为35.1%,经青枯菌接种12 h后,中花12号降低到31.3%,而远杂9102的基因组DNA甲基化比率则升高至37.2%。与对照相比,青枯菌接种12 h胁迫下中花12号和远杂9102基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为5.9%,12.4%,18.3%,11.9%。由此推测,高抗青枯菌的花生经青枯菌侵染后基因组DNA某些位点的甲基化状态发生变化而使基因表达发生了改变,产生或启动对青枯菌胁迫的能动应激机制。     

冷驯化不同阶段茶树DNA甲基化模式的变化

低温胁迫是影响茶树产量、生长发育和地域分布的重要环境因子之一,需要通过冷驯化的诱导来提高其抗寒性。DNA甲基化是植物表观遗传的重要方式,环境胁迫会引起植物DNA甲基化状态的改变。为研究DNA甲基化是否参与茶树的低温响应,本研究利用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)和高效液相色谱法(HPLC),分析了不同冷驯化阶段茶树基因组DNA甲基化水平及状态变化。MSAP分析结果表明,50对选择性扩增引物在对照、驯化后和脱驯化样品中分别扩增出905、968和970个甲基化条带,总甲基化位点比例分别为50.6%、54.1%和54.2%。与未驯化的样品相比,冷驯化后和脱驯化的样品基因组DNA甲基化水平升高。HPLC的检测结果与MSAP结果类似。进一步分析甲基化模式发现,与对照相比,茶树冷驯化过程中同时发生了甲基化和去甲基化现象,但总体变化趋势表现为甲基化水平的增加。表明茶树在抗寒响应中出现DNA甲基化现象。     

铅胁迫下红麻生理特性及DNA甲基化分析

DNA甲基化在植物响应生物和非生物胁迫中起重要作用,但是有关铅胁迫下植物DNA甲基化水平变化的研究报道甚少。本研究以红麻P3A为材料,采用水培法对幼苗进行不同浓度(0、200、400、600μmol L-1) PbCl2处理,测定幼苗农艺性状、根系ROS含量和抗氧化酶活性等变化情况;利用甲基化敏感扩增多态性技术(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析600μmol L-1铅胁迫条件下根系DNA甲基化水平变化,回收差异甲基化片段并克隆测序,采用qRT-PCR技术对DNA甲基化差异基因进行表达分析。结果表明,不同浓度PbCl2胁迫均显著抑制幼苗的茎粗、根长和根表面积,且400μmol L-1及以上浓度PbCl2胁迫显著抑制红麻幼苗的株高和全鲜重。随着铅浓度的提高,红麻幼苗根系的铅含量显著升高, O2?和MDA含量显著增加, SOD活性显著升高, POD活性呈先降低后升高, CAT活性呈先升高后降低的趋势。对照及600μmol L-1 PbCl2处理下的幼苗根系DNA甲基化率分别为71.13%、62.20%,其中全甲基化率分别为50.52%、37.80%,半甲基化率分别为20.62%、24.40%,即铅胁迫显著降低了红麻幼苗根系的DNA甲基化率和全甲基化率,提高了根系的半甲基化率。qRT-PCR分析表明, 7个与抗性密切相关的DNA甲基化差异基因也存在表达量差异,推测DNA甲基化水平变化在响应红麻铅胁迫中发挥重要作用。本结果为深入探索DNA甲基化响应植物非生物胁迫的潜在机制,以及生产上利用红麻改良土壤铅污染提供了理论基础。     

巴西橡胶树DNA甲基化的MSAP分析

本文采用"甲基化敏感扩增多态性"(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)的分析方法,在全基因组水平检测巴西橡胶树DNA甲基化位点,确定巴西橡胶树基因组DNA甲基化模式和水平。结果表明:16对MSAP引物选择性扩增,共扩增262条带,其中甲基化位点87个,甲基化比例为33.21%,其中,半甲基化位点为32个,比例为12.22%;全甲基化位点为55个,比例为20.99%。对部分巴西橡胶树基因组甲基化位点进行回收,最终分离了18条存在甲基化的基因组DNA序列。BLAST比对后,同源分析表明巴西橡胶树基因组中包括转录因子、蛋白激酶等在内的多种类型的DNA序列中均存在甲基化现象。本研究为深入研究巴西橡胶树的DNA甲基化奠定基础。     

Na2CO3对黄秋葵种子萌发及生理特性的影响

为研究碱环境下黄秋葵种子萌发及生理特性,采用不同浓度(0、10、20、30、40 mmol·L^-1)Na2CO3溶液处理黄秋葵种子,测定其种子的萌发特性、胚根生长速度及第3天时胚根的生理特性。结果表明,随着碱浓度的增加,种子的发芽率、发芽势、发芽指数呈下降趋势,相对碱害率升高;发芽期间胚根长度与碱浓度呈负相关关系,且生长速度降低;碱胁迫下种子的抗氧化物酶(POD、CAT、SOD)活性较对照组无显著变化,MDA随碱浓度增加呈升高趋势,脯氨酸积累量变化不明显。发芽7 d后对照和10 mmol·L^-1碱液处理可萌发为幼苗,对其复水5 d后,发现10 mmol·L^-1处理侧根生长量远少于对照组。说明碱胁迫能抑制黄秋葵种子萌发及其幼苗生长,但黄秋葵种子对10 mmol·L^-1碱胁迫具有耐受性。     

水分胁迫下马铃薯基因组DNA甲基化水平变化分析

DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要研究内容之一,在植物生长发育和响应逆境胁迫等过程中起重要作用,其中水分胁迫是对植物生长发育最具危害的逆境胁迫之一。为探索马铃薯DNA甲基化与水分胁迫之间的关系,本研究采用PEG-6000模拟水分胁迫处理两个马铃薯品种‘青薯9号’和‘大西洋’,在PEG0%(对照),5%和10%浓度下,利用MSAP技术检测‘青薯9号’和‘大西洋’甲基化水平变化情况。结果表明:在相同条件下,抗旱型品种‘青薯9号’甲基化水平高均于干旱敏感型品种‘大西洋’。在0%(对照)、5%和10%PEG胁迫下,‘青薯9号’MSAP比率为42.49%、38.14%、49.21%,甲基化水平与对照相比先降低后升高,‘大西洋’MSAP比率29.17%、22.92%、17.58%,甲基化水平逐渐降低。经统计,5%PEG和10%PEG胁迫下,‘青薯9号’和‘大西洋’均出现甲基化和去甲基化现象,其中‘青薯9号’甲基化和去甲基化比率分别为10.92%、6.43%和11.98%、15.36%,‘大西洋’分别为1.59%、8.22%和42.18%、24.34%,甲基化变异模式以去甲基化为主。‘青薯9号’和‘大西洋’均能发生CNG、CG和CG/CNG位点的甲基化和去甲基化,在水分胁迫下会产生较多的CNG和CG/CNG位点。本研究结果为探究马铃薯抗旱机制提供了理论基础。     

大豆苗期耐盐性的简便鉴定方法

盐胁迫是影响大豆产量的重要非生物胁迫因素,筛选耐盐种质资源对培育耐盐大豆品种具有重要的意义。本研究利用4个耐盐品种和4个盐敏感品种进行苗期耐盐性鉴定,以蛭石为培养基质,在大豆真叶展开时,分别用100、200和250 mmol L^–1的NaCl溶液处理,每2 d浇一次盐溶液,每天测定大豆真叶SPAD值。盐处理8 d后,分别取各品种的根、茎、叶,用原子吸收光谱仪测定其Na⁺含量。结果表明,用200 mmol L^–1 NaCl处理的耐盐品种和盐敏感品种表型差异明显,但叶片Na⁺含量差异不显著;用250 mmol L^–1 NaCl处理后,表型差异明显且叶片Na⁺含量差异显著。200 mmol L^–1和250 mmol L^–1 NaCl处理下叶片失绿明显,盐敏感品种叶片积累的Na⁺含量与SPAD值极显著负相关。本研究建立了一种以蛭石为基质,用200 mmol L^–1或250 mmol L^–1 NaCl处理,8 d即可进行大豆苗期耐盐性鉴定的简便方法,为大豆种质资源苗期耐盐性的大规模鉴定及耐盐品种选择和耐盐机理的研究提供了方法。     

室外盆栽条件下盐胁迫对甜高粱光系统II活性的影响

室外盆栽条件下, 设置2个NaCl浓度(100 mmol L^–1和200 mmol L^–1), 调查盐胁迫对甜高粱光合特性和光系统II (PSII)活性的影响。结果表明,叶片Na⁺离子含量与Na⁺/K⁺比随盐浓度增加和处理时间延长而增加。净光合速率(P_n)、光系统II开放反应中心天线转化效率(F_v¢/F_m¢)、光化学猝灭系数(q_P)和光系统II实际光化学效率(Φ_PSII)随盐浓度的增加而降低,非光化学猝灭(NPQ)随盐浓度增加而增加;100 mmol L^–1处理组的P_n、F_v¢/F_m¢、q_P和Φ_PSII随处理时间延长有所恢复,但200 mmol L^–1处理组无此现象。光系统II (PSII)最大光化学效率(F_v/F_m)在100 mmol L^–1 NaCl处理时影响较小,但在200 mmol L^–1 NaCl处理时明显下降。短期盐胁迫未影响荧光诱导动力学曲线,而200 mmol L^–1 NaCl处理5 d后荧光诱导动力学曲线O-K和O-J相上升。进一步研究证明,PSII的失活速率在两个盐浓度下均无明显变化,而修复速率在200 mmol L^–1盐浓度处理5 d后降低明显。因此,认为室外盆栽条件下盐胁迫造成甜高粱碳同化能力降低并改变PSII激发能分配;叶片Na⁺离子含量的大幅增加会导致PSII活性下降及光抑制,这与PSII失活速率无关,主要是失活PSII修复速率受抑制的结果。这对理解户外盐胁迫条件下C₄作物的光抑制机制具有一定意义。     

蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力

Hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因Hrip1转化到拟南芥,对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明Hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。3周龄的转基因植株在250 mmol L⁻¹ NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L⁻¹ NaCl和200 mmol L⁻¹甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。说明蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。     

冠菌素对棉花幼苗盐害的缓解效应

 以转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)中棉所45为材料,通过水培试验研究了冠菌素对盐胁迫下棉花萌发出苗和幼苗生长的影响。结果表明,盐胁迫严重抑制棉花种子萌发和幼苗生长,且对地上部的抑制程度大于对根系的抑制。盐胁迫对棉花萌发出苗和幼苗生长的抑制程度能被0.01 μmol·L^-1 的冠菌素缓解。苗期盐胁迫21 d内,冠菌素处理的棉花根、茎和叶的生物积累量较未施加冠菌素的盐处理增加1倍;活体组织化学原位检测结果显示,低浓度冠菌素处理降低盐胁迫诱导的主根H₂O₂含量。上述研究结果说明低浓度的冠菌素能提高棉花萌发出苗和苗期的耐盐性。     

NaCl 胁迫对棉花叶片衰老特征的影响及其生理学机 制简

 以叶片衰老快慢不同的两个棉花品系L21和L22为材料,研究了NaCl胁迫对棉花叶片衰老的影响及其相应的生理学机制。温室内水培棉苗,待第5片真叶展开20 d后用含125 mmol·L^-1 NaCl的营养液处理棉苗,以不含NaCl的营养液处理为对照。结果显示,NaCl胁迫下L21和L22叶片中叶绿素含量和光合作用速率下降,叶片和根中的Na⁺含量上升、K⁺含量降低;NaCl胁迫还增加了棉株体内脱落酸（ABA）含量、降低了玉米素核苷（ZR）含量。表明K+含量降低以及ABA含量升高、ZR含量下降是NaCl胁迫促进棉花叶片衰老的重要原因。     

盐胁迫条件下外源Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜K+通道的调控

研究了Ca²⁺ 对NaCl胁迫下蚕豆气孔运动及质膜K+通道的影响。结果表明,100 mmol L^-1 NaCl可明显诱导气孔开放,该现象可被10 mmol L^-1 CaCl₂ 显著抑制。为探讨盐胁迫下Ca²⁺对K⁺和Na⁺跨膜运输的调控机制,我们利用膜片钳技术记录全细胞K⁺ 电流发现,在100 mmol L^-1 NaCl胁迫下,加入10 mmol L^-1 CaCl₂胞外处理,显著抑制质膜K+内向及外向通道电流,这种抑制可被1 mmol L^-1 La³⁺ (Ca²⁺通道抑制剂)缓解。非盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 胞外处理也能显著抑制质膜内向K⁺通道,但明显激活其外向通道,加入1 mmol L^-1 La³⁺并不能被缓解。用H₂O₂专一的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)单细胞分析保卫细胞内H₂O₂含量变化显示,在100 mmol L^-1 NaCl盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 处理明显诱导H₂O₂在保卫细胞中积累;100 mmol L^-1 NaCl和10 mmol L^-1 CaCl₂单独处理并不能诱导H₂O₂积累。推测Ca²⁺在盐胁迫下可能先诱导H₂O₂在胞内积累,进而激活质膜Ca²⁺通道,迅速提高胞内Ca²⁺浓度以抑制Na⁺通过质膜K⁺通道跨膜内流,同时调节Na⁺外流,两种效应共同作用促使气孔关闭,减少盐胁迫下水分的过度散失。上述结果将为Ca²⁺调控作物抗盐机制研究提供新的思路。     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。     

利用子房滴注法获得转高亲和性钾离子转运蛋白基因(AlHAK1)棉花植株

棉花植株再生困难、基因型依赖性强和转化周期长等因素一直制约着棉花遗传转化的发展。本研究利用1种不依赖组织培养的转化方法 ,即子房滴注转化方法将獐茅高亲和性钾离子转运蛋白基因(Al HAK1)导入棉花基因组中。结果表明在1006株转化幼苗中有44株为卡那抗性植株,其中35株经PCR检测为阳性(T0代),转化率为3.5%。Southern与Northern杂交结果进一步表明外源基因已整合至棉花基因组中并在转录水平上表达。在提供外源0.05 mmol·L-1 K+水平下,T1转基因棉花叶片中K+含量约为对照植株的2倍,在根中约为野生型植株的1.5倍;而在2.5 mmol·L-1 K+的正常水平下,转基因棉花与野生型植株K+含量差异不明显。在50~200 mmol·L-1 Na Cl胁迫条件下,转基因棉花的种子发芽率明显高于野生型植株,尤其是在150mmol·L-1Na Cl胁迫条件下,转基因植株种子的发芽率是野生型的2.8倍左右。本研究为子房滴注转化体系在生产实践中的广泛应用提供了理论依据,并为培育适应土壤钾素匮乏及盐渍化环境下生长的棉花新品种提供了新的种质资源。     

赤霉素对盐胁迫抑制水稻种子萌发的缓解作用的蛋白质组分析

用粳稻日本晴(Oryza sativa L. cv.Nipponbare),研究了盐胁迫对水稻种子萌发的抑制作用和赤霉酸(GA₃)对盐胁迫的缓解作用;分别以H₂O (对照）,5 g L^-1 NaCl (处理I),5 g L^-1 NaCl + 100 μmol L^-1 GA₃(处理II)培养水稻种苗48 h,提取芽中的蛋白质,利用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术分析了水稻蛋白质组的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,日本晴种子的萌发显著受到抑制,而GA₃能显著缓解这种抑制作用;用ImageMaster软件分析2-DE凝胶,发现有4个蛋白质斑点表现出显著的变化,在盐胁迫下斑点S1、S2和S3表达下调而斑点S4消失,在GA₃与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复;经MALDI-TOF MS分析,其中2个蛋白质斑点(S1,S3)分别被鉴定为isoflavone reductase-like蛋白与葡萄糖磷酸变位酶,这些蛋白可能与GA₃提高水稻耐盐性途径相关。