黄瓜生长素反应因子(ARF)家族鉴定及表达特异性分析

【目的】鉴定黄瓜生长素反应因子（ARF）,预测small RNAs并验证ARF与small RNAs和生长素的关系;分析ARF在种子萌发过程中的表达模式,推断ARF在黄瓜单性结实和种子萌发过程中是否起到关键作用。【方法】利用拟南芥和水稻ARF蛋白质序列检索黄瓜基因组数据库,对检索到的黄瓜ARF家族进行结构分析和small RNAs预测;将预测到的gma-MIR160o precursur构建到pCAMBIA2301植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其导入到单性结实黄瓜品种中,并对PCR检测为阳性的转基因植株进行RT-PCR验证;利用real-time RT-PCR方法分析ARF家族成员在生长素诱导后、开花时期及种子萌发阶段的表达模式。【结果】通过与拟南芥和水稻ARF蛋白序列的比对,共得到18个黄瓜ARF蛋白质序列。将其连同拟南芥和水稻的ARF蛋白质序列共分为4大类。从结构上看,外显子数目2-18不等,但同一类之间基因结构较为相似。进化树分析显示,18个基因之间的相似性不高;18个黄瓜ARF基因均有相对应的small RNA。其中, Csa010564、Csa011935、Csa015176、Csa020560和Csa022361可能都是miR160的靶基因。转基因试验进一步说明Csa010564、Csa011935和Csa015176在表达量上出现下降趋势,而Csa020560和Csa022361的表达量与对照相比略有上升,说明Csa010564、Csa011935和Csa015176是miR160的靶基因;在生长素诱导表达的试验中,Csa007296、Csa011935和Csa015176在根、茎和叶中的表达量均高于对照,说明ARF的表达受IAA的正调控;同时,以上3个基因在叶片和雌花花冠中的表达量均是开花第2 d低于开花当天,而在子房中的表达量确是第2天高于开花当天,尤其是Csa011935和Csa015176上调显著,说明ARF在子房发育过程中起到至关重要的作用;ARF在种子萌发过程中的表达分析显示：大部分基因在吸涨后12 h和48 h处于表达最高峰。【结论】ARF受生长素和相应的small RNAs调控。在黄瓜单性结实和种子萌发过程中,ARF可能起到了关键性作用。     

大白菜BrARGOS基因的分离与功能分析

 【目的】从大白菜自交系日喀则的叶片中分离新的拟南芥ARGOS的同源基因,进行氨基酸序列比对和该基因的表达模式分析,转化拟南芥分析其功能,并分析该基因的表达量与大白菜叶杂种优势之间的关系。为在大白菜中研究该基因的功能提供依据。【方法】利用RT-PCR从大白菜叶中分离出ARGOS同源基因的cDNA序列,采用DNAMAN软件分析该基因所编码的蛋白质的二级结构,通过半定量RT-PCR检测该基因在大白菜各器官中的表达水平,分析转基因拟南芥的表型鉴定该基因的功能,通过半定量RT-PCR分析该基因的表达量与大白菜叶的杂种优势之间的关系。【结果】根据拟南芥ARGOS序列,通过Blast检索到大白菜BAC库中的序列,根据该序列设计特异引物,以提取自日喀则叶片的RNA反转录产物为模板,通过PCR扩增出1个新的ARGOS的同源基因BrARGOS。对大白菜、拟南芥和番茄中3个基因所编码的蛋白质做序列比对分析发现,这3个蛋白质的C末端富含亮氨酸。BrARGOS蛋白的二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋。通过半定量RT-PCR分析,在大白菜各器官中均检测到BrARGOS基因的表达,在果荚中表达量最高,其次为子叶,茎生叶中表达量最低。通过PCR检测阳性转化体拟南芥基因组显示,NPTⅡ基因已经转入拟南芥基因组中,表明外源BrARGOS基因也同时转入拟南芥基因组中。与转空载体对照拟南芥相比,过量表达BrARGOS基因的转基因拟南芥的叶、花、叶鲜重和株高均显著增大/高。【结论】从大白菜自交系日喀则叶片中分离了1个新的ARGOS的同源基因BrARGOS,并分析了BrARGOS基因的表达模式和功能。在拟南芥中过量表达BrARGOS基因使拟南芥的地上器官显著增大。大白菜BrARGOS基因可能与调节植物器官大小有关。     

黄瓜CC-NBS-LRR家族基因鉴定及在霜霉病和白粉病胁迫下的表达分析

【目的】对黄瓜全基因组的CC-NBS-LRR（CNL）基因家族进行生物信息学和表达模式分析,为深入研究CNL基因家族在黄瓜生长、发育和病害胁迫响应中的功能提供参考。【方法】以拟南芥CNL为参考序列,利用本地Perl语言和Pfam等软件检索黄瓜‘9930’基因组并确定黄瓜CNL基因家族成员。通过ExPASy、GSDS2.0、MEGA、MEME、Tbtools、Mev等工具对黄瓜CNL家族基因进行生物信息学分析。根据转录组数据库、霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）、白粉病菌（Podosphaera xanthii）接种处理和实时荧光定量PCR技术分析该类基因的表达模式。【结果】从黄瓜全基因组中鉴定得到17个CsCNL,这些基因分布在除1号染色体外的6条染色体上,其编码蛋白与其他植物CNL结构相似,均含有CC、NBS和LRR保守结构域,蛋白质大小介于197—1 148 aa,分子量在22.6—131.3 kD,等电点在5.71—8.38。共线性分析表明其中不存在片段重复和串联重复基因,多物种系统进化关系表明,CsCNL基因家族成员在葫芦科植物之间具有较高的结构和功能相似性。CsCNL启动子中存在多种与抗病相关的顺式作用元件。CsCNL表达具有组织特异性。在接种霜霉病菌2 d和5 d后,Csa3G815400、Csa3G822360和Csa7G420890在抗性品种中均显著上调表达,Csa4G015850在抗性品种中下调表达,在敏感品种中显著性表现不一;在接种白粉病菌2 d和5 d后,Csa2G008000和Csa3G684170在敏感品种中显著上调表达,在抗性品种中显著下调表达;Csa4G016360、Csa7G420890和Csa7G425940在抗性品种中显著上调表达,在敏感品种中表达量无变化或显著下调。【结论】CsCNL家族成员具有组织表达特异性并且多数基因能够响应霜霉病菌和白粉病菌的胁迫。推测Csa3G815400、Csa3G822360和Csa7G420890表达量增加,Csa4G015850表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的霜霉病抗病反应;Csa4G016360、Csa7G420890和Csa7G425940表达量增加,Csa2G008000和Csa3G684170表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的白粉病抗病反应;而Csa7G420890表达量的增加能同时诱发抗病黄瓜品种的霜霉病和白粉病的抗病反应。     

甜瓜霜霉病苗期抗病性鉴定方法建立及种质资源评价

【目的】研究甜瓜霜霉病苗期人工接种鉴定的最佳方法,并对甜瓜资源进行苗期接种鉴定,为抗病育种提供抗源。【方法】采用不同接种方法,不同接种苗龄,不同接种浓度三因素三水平正交试验设计,建立甜瓜霜霉病苗期抗性鉴定方法,并对208份新疆哈密瓜资源和国内引进甜瓜资源进行霜霉病抗病性评价。【结果】甜瓜苗期接种霜霉病最好的方法是喷雾法,接种苗龄为2叶期,接种的最适浓度为5×10³孢子/mL;筛选出免疫甜瓜霜霉病资源5份,高抗资源7份,中抗资源6份。【结论】甜瓜苗期接种霜霉病方法的确立以及抗霜霉病资源筛选为抗病育种奠定了基础。     

黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因CsTPST克隆及其表达分析

【目的】克隆黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因(CsTPST),并分析植物多肽在发育过程中的调控作用,为研究CsTPST的功能及多肽与乙烯在黄瓜发育过程中的相互作用打下基础。【方法】以拟南芥TPST蛋白序列信息为基础进行同源比对,经PCR扩增和生物信息学分析获得CsTPST基因序列信息、结构和亲缘关系,并利用qRT-PCR对其表达模式进行分析。【结果】CsTPST基因cDNA全长789 bp,编码262个氨基酸。进化分析结果表明,CsTPST蛋白与甜瓜的TPST蛋白亲缘关系最近,其氨基酸序列相似性为93%。 qRT-PCR分析结果表明,CsTPST基因在黄瓜雌花、根和叶片中表达量较高,在雄花和茎中表达量较低。此外,CsTPST基因在乙烯合成促进剂ACC处理的黄瓜叶片中上调表达,而在乙烯合成抑制剂AVG处理下呈下调表达。 CsTPST基因启动子能激活GFP基因的表达。【结论】CsTSPT基因是一个受乙烯诱导表达的基因,可供开展CsTPST基因的生物学功能及性别决定的分子机理研究参考。     

白菜硫代葡萄糖甙合成中MAM 的进化分析

【目的】探索硫代葡萄糖甙合成中关键基因-甲基硫代烷烃基苹果酸合成酶（methylthioalkylmalate,MAM）基因在白菜基因组中的进化情况,为研究白菜MAM的功能提供理论指导。【方法】根据白菜数据库BARD信息分析拟南芥、盐芥和白菜MAM的共线性关系,利用MEME在线软件预测MAM序列的高度保守基序（motif）,通过R软件分析93份白菜材料MAM的表达模式,并利用MEGA5.05软件构建MAM的系统进化树。【结果】白菜的3个亚基因组均保留着MAM的同源基因。其中与拟南芥具有共线性的5个同源基因可能源自基因组古三倍化复制,其它两个同源基因可能是由转座扩增产生的;基序分析结果表明,与拟南芥的MAM相比,白菜的MAM同源基因存在基序的缺失,并且大多发生在序列的两端;在93份白菜材料中,白菜MAM同源基因之间的表达量有很大差异,Bra021947与Bra018524只在少数材料中存在极低的表达,并且Bra029356的表达量低于可检测水平;进化树分析发现,除Bra018524外,其他的白菜MAM同源基因与拟南芥的MAM聚集在不同的分支上。【结论】白菜的MAM可能在拟南芥和白菜物种分化之后独立起源并进化出不同的功能。     

中国野生刺葡萄抗白腐病NBS-LRR类抗病基因 同源序列的分离与鉴定

【目的】通过同源克隆法从刺葡萄‘高山2号’叶片中得到抗白腐病基因的同源片段,为筛选葡萄抗白腐病基因奠定基础。【方法】根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守区设计简并引物,从高抗葡萄白腐病刺葡萄‘高山2号’的基因组DNA与cDNA上得到抗病基因同源片段(RGAs),并对其表达分析进行检测。【结果】从刺葡萄‘高山2号’上获得了10个NBS-LRR类抗病基因同源片段,10条葡萄RGAs间在氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性,进一步分析发现,在10条葡萄RGAs中,4个推测所属基因为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,6个所属基因为TIR-NBS-LRR类抗病基因。定量PCR分析表明,NB7基因受到白腐菌的诱导,而且NB7基因在刺葡萄叶片中为低丰度表达,NBS6基因受到白腐菌的诱导后为下调表达。【结论】在刺葡萄上成功获得了抗病基因同源序列,通过荧光定量PCR分析发现,NB7基因与NBS6基因都受到白腐菌的诱导表达,为最终克隆得到葡萄抗白腐病基因奠定基础。     

甜瓜果形基因CmSUN25-26-27a的鉴定和分子标记

【目的】挖掘甜瓜果形相关基因,为甜瓜果实形状的遗传改良提供理论基础。【方法】通过全基因组鉴定,系统发育分析,结合表达量与果形的关联分析来鉴定参与甜瓜果形调控的CmSUN基因,并利用候选基因在自然群体中的序列变异开发相关分子标记。【结果】通过全基因组鉴定及系统发育分析,鉴定到甜瓜CmSUN家族的CmSUN25-26-27a基因。该基因在开花当天的雌花中有显著的表达,并且在不同果形甜瓜中的表达量与果形指数(fruit shape index,FSI)呈正相关关系;对200份自然群体的序列分析发现,CmSUN25-26-27a基因编码区存在一个SNP-Single Nucleotide Polymorphism(A/G),导致了编码氨基酸的非同义突变,含有CmSUN25-26-27a A等位基因的厚皮甜瓜的FSI显著高于含CmSUN25-26-27a G等位基因的厚皮种质。该SNP位点将厚皮甜瓜按果形大致分为FSI>1.5(A)和FSI <1.5(G)两种类型。根据该SNP位点设计了用于区分甜瓜果形的dCAPS标记。【结论】CmSUN25-26-27a同源基因广泛参与葫芦科作物的...     

黄瓜Ca2+ 家族序列特征及其表达特性分析

通过黄瓜基因组数据库,采用生物信息学方法获得15个黄瓜Ca~(2+)家族序列,并对其染色体位置、基因组位置、氨基酸长度、转录起始位点和Pfam匹配结构域数进行预测;利用RT-PCR方法对所有搜索到的Ca~(2+)家族基因进行组织特异性分析;对黄瓜植株进行低温处理,分析黄瓜Ca~(2+)基因家族的表达情况。结果显示:15个基因中除Csa021245未定位以外,其余均匀分布在1~6号染色体上,一致性为47.67%;Csa001688、Csa009857和Csa009360等3个基因的5′区出现CpG岛结构;组织表达特异性分析结果显示,Csa001688、Csa006826、Csa010172和Csa016434在叶中表达量最高,Csa003758、Csa010172和Csa018949在根中表达量最高;进化树分析结果显示,只有Csa010172和Csa009360与拟南芥AtACA2亲缘关系最近,这些基因可能在Ca~(2+)家族信号传导过程中起着主要作用;实时定量表达分析表明,Ca~(2+)基因家族参与黄瓜对低温胁迫的应答。     

黄瓜单性结实性状遗传与QTL定位

【目的】单性结实性是影响设施黄瓜产量和品质的重要性状。深入解析黄瓜单性结实性状遗传规律并对其进行QTL定位,有助于提高设施专用黄瓜品种育种效率。【方法】以强单性结实自交系‘6457’和弱单性结实自交系‘6426’构建的重组自交系F2:8为材料,基于3年表型数据,采用黄瓜基因组测序SSR分子标记构建黄瓜遗传连锁图谱,结合QTL-Seq分析,对黄瓜单性结实性进行QTL定位。【结果】黄瓜单性结实性状符合数量遗传特征。利用SSR标记构建了1张包含11个连锁群的遗传图谱,覆盖基因组555.0 cM,平均图距为6.8 cM。2016—2018年春季在3号染色体上均检测到1个与黄瓜单性结实性相关的QTL位点,位于标记SSR19430和SSR15419之间(3.33—5.57 Mb),遗传距离6.6 cM,贡献率分别为11%、12.5%和6.3%。进一步进行QTL-Seq分析,发现4个与黄瓜单性结实性相关的QTL,分别位于1号(4.38—11.00 Mb)、3号(2.24—10.66 Mb)、6号(15.67—17.93 Mb,26.33—27.49 Mb)染色体上。其中在3号染色体上检测到的QTL与Map QTL所得的QTL区间重叠。推测Csa3G047740、Csa3G073810、Csa3G043910和Csa6G362930为与黄瓜单性结实性状相关的候选基因。【结论】分别在1、3、6号染色体上检测到4个与黄瓜单性结实性相关的QTL位点,其中3号染色体上的QTL年度间稳定,贡献率较高。     

基于BSA-Seq技术的甜瓜抗霜霉病InDel标记开发

目的 获得与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记或功能标记,用于甜瓜分子标记辅助选择育种。为进一步克隆甜瓜抗霜霉病主效基因奠定基础。方法 以野生高抗霜霉病资源DM-4和感病自交系DM-2为亲本,构建F₂代分离群体,利用BSA-seq对甜瓜抗霜霉基因进行QTL定位,开发InDel分子标记,并在双亲及其F₂群体单株进行筛选验证。结果 甜瓜抗霜霉病主效QTL位于第9号染色体。在候选区间开发了37个InDel分子标记,有9个PCR产物大小在抗、感双亲表现出差异,用F₂单株验证,结合田间表型鉴定结果,引物InDel 15和InDel 20准确率分别为95 %和98 %,引物InDel 15和InDel 20在抗病亲本中扩增产物大小分别为251和349 bp,在感病亲本中分别为231和324 bp。结论 引物InDel 15和InDel 20可以作为分子标记进行抗霜霉病辅助选育,加快了甜瓜抗霜霉病育种速度。     

BTH诱导黄瓜幼苗对霜霉病的抗性与细胞壁HRGP和木质素含量的关系

【目的】苯并噻二唑（BTH）对黄瓜幼苗霜霉病的诱导抗性与苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、过氧化物酶（POD）活性、木质素和富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量的关系。【方法】用比色法对BTH诱导或接种霜霉菌的植株进行PAL和POD活性以及木质素和HRGP含量的测定。【结果】BTH不仅能提高黄瓜幼苗对霜霉病的抗性，而且明显提高了PAL和POD的活性以及木质素和HRGP的含量。BTH诱导处理和霜霉菌侵染黄瓜叶片，细胞壁中HRGP的积累与木质素的沉积在时间进程中表现出明显的同步性。【结论】HRGP的积累和细胞壁的木质化与黄瓜对霜霉病的抗性反应有关，是寄主抗病反应的生化机制之一。     

黄瓜幼苗下胚轴长度GWAS分析及候选基因挖掘

【目的】挖掘与黄瓜幼苗下胚轴长度显著相关的SNP位点及候选基因,为揭示下胚轴长度的遗传基础和分子机制提供理论依据,为短下胚轴分子标记辅助选择育种奠定基础。【方法】以95份黄瓜核心种质为试验材料,分别于2016年春季、2017年春季、2017年秋季和2018年春季在中国农业科学院南口试验基地塑料大棚进行种植,在两叶一心期调查黄瓜幼苗的下胚轴长度;利用Structure 2.3.4软件分析群体结构,Haploview 软件分析连锁不平衡的衰减;基于最优模型对下胚轴长度进行全基因组关联分析（GWAS）,依据关联SNP位点的LD区间序列,预测与下胚轴长度相关的重要关联候选基因,并利用荧光定量PCR对预测基因进行表达模式分析。【结果】共检测到8个显著关联的位点（Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1）,分别位于1、2、3、4、5、6号染色体,其中,Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl5.1、Hl6.1等5个位点被重复检测到两次以上。通过分析关联SNP位点的LD区间序列,获得Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970 8个与黄瓜下胚轴长度有关的候选基因,其中既有光形态建成、泛素化、激素信号通路等调控基因,也有调控网络下游参与细胞生长发育,调节细胞大小,直接调控黄瓜下胚轴长度的基因。多基因在不同黄瓜材料中的有机分布,形成了具有不同下胚轴长度的黄瓜种质。基因表达分析显示Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa4G051570、Csa5G174640在短下胚轴材料中高表达。Csa3G141820、Csa3G627150在长下胚轴材料中高表达。【结论】检测到Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1等8个与黄瓜下胚轴长度密切关联的SNP位点,挖掘到Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970等8个调控下胚轴长度的候选基因。     

黄瓜霜霉病诱导抗性的研究进展

黄瓜霜霉病是一种世界性病害,也是保护地黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本文概述了黄瓜霜霉病诱抗剂种类、诱抗机制、抗霜霉病相关基因等方面的研究进展,并对未来发展趋势提出了展望。     

采用GBS-seq技术构建甜瓜高密度遗传图谱

【目的】构建甜瓜高密度遗传图谱,为研究甜瓜重要性状基因定位及功能分析奠定基础。【方法】以甜瓜材料K7-4(高抗霜霉病)和K7-2(高感霜霉病)为亲本,杂交再自交得到 F₂分离群体。构建GBS文库并进行双末端测序,使用滑动窗口的方法进行基因型分型,SAM TOOLS软件检测SNP位点,采用Joinmap 4.0软件进行排图,用perl SVG模块绘制连锁图,用win QTL cart 2.5进行QTL检验,根据复合区间作图法,使用R/qtl软件包进行QTL定位。【结果】构建了总长为4 823.55 cM的遗传图谱,标记间平均遗传距离为1.43 cM。在苗期、生长中期和生长后期共检测到26个与甜瓜霜霉病性状相关的QTL。【结论】基于GBS-seq技术获得了甜瓜高密度遗传图谱,最终将抗霜霉病基因关联到CM3.5.1_scaffold00005上的6,831,227~7,830,935 bp,约1Mb的区间范围内。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

黄瓜霜霉病菌与抗性研究进展

科学利用抗性品种及抗性基因是控制黄瓜霜霉病最经济、有效的途径。文章对黄瓜霜霉病菌及其抗病性的相关研究进行了全面综述,总结了黄瓜霜霉病菌的侵染和流行规律,比较分析了国内外不同学者在接种和抗霜霉病性鉴定等方面存在的差异,论述了抗病基因定位的主流方法和最新技术,指出控制霜霉病抗病基因目前尚存在单基因、多基因的不同结论。提出今后应加强轻简化和标准化的抗病性鉴定方法研究,明确霜霉病抗性基因,筛选和创制出更多、更优异的抗性品种和资源。