褐黄血蜱中肠内容物菌群结构分析

为了解褐黄血蜱的带菌情况及其公共卫生意义,本研究在无菌条件下采集褐黄血蜱中肠内容物,提取细菌总DNA为模板,采用通用引物PCR扩增细菌16S r DNA V3区,经DGGE电泳回收DGGE 16个优势条带,并选取其中13个条带进行测序分析,结果显示,选取条带分别与立克次氏体属、柯克斯氏体属、假单胞菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌属等高度相似。采用传统细菌学方法,从中肠内容物培养分离到2株细菌,经鉴定其中1株为蜡样芽胞杆菌。对各地区褐黄血蜱半饱血雌成蜱和吸血雄成蜱中肠菌群结构分析结果表明其带菌情况基本相同,但饱血雌成蜱3个地区间具有较大的差异;而饱血雌蜱和其它两种状态下的蜱肠道菌群也有差异。贝纳柯克斯氏体、菊欧文氏菌、肺炎克雷伯菌及软腐果胶杆菌是褐黄血蜱中肠内的优势菌。本研究利用PCR-DGGE技术分析褐黄血蜱中肠内容物,为蜱传播疾病的研究奠定基础。     

羊源长角血蜱吸血后中肠优势菌群分析

本研究采用PCR-DGGE技术分析长角血蜱的中肠菌群结构。无菌条件下采集长角血蜱中肠内容物,以细菌基因组DNA提取试剂盒提取内容物细菌总DNA,以通用引物扩增制备16S r DNA V3区,DGGE电泳分离后,切胶回收、测定序列。结果表明,长角血蜱饱血雌成蜱中肠优势菌为泛菌属、柯克斯氏体属、肠杆菌属、绿脓杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属,但半饱血雌成蜱和雄成蜱中肠未检测到柯克斯氏体属(Coxiella)。     

甘肃省部分牛羊血液原虫传播媒介的实验研究

利用蜱传播试验,确定了甘肃省一些牛羊血液原虫的媒介和传播方式。甘肃省牛的双芽巴贝斯虫媒介为微小牛蜱。大巴贝斯虫媒介为长角血蜱。瑟氏泰 勒虫媒介为长角血蜱;绵羊无浆体的媒介为草原革蜱。微小牛蜱、长角血蜱可分别传播双芽巴贝斯虫和大巴贝斯虫,传播方式为经卵传递。将采集于甘肃文县牛体上的微小牛蜱和两当县的长角血蜱饱血雌虫孵育而来的次代幼虫分别叮咬除脾牛体后,２头牛各自感染双芽巴贝斯虫或大巴贝斯虫。将采自崇     

一株白僵菌的分离鉴定及其对微小牛蜱的致病力试验

为了得到用于防控微小牛蜱的高毒力菌株,本试验从野外微小牛蜱饱血雌蜱体表分离出一株白僵菌,通过形态学和分子生物学方法进行了鉴定,确认该分离株为球孢白僵菌.致病力研究表明,当孢子浓度达到108孢子/mL,该菌株对微小牛蜱饱血成蜱的致死率即可达到100%,为微小牛蜱的生物防控试剂的研究及应用奠定了基础.     

不同饱血状态草原革蜱与森林革蜱中肠菌群结构的对比与分析

为探明草原革蜱和森林革蜱不同饱血状态下中肠菌群结构的特点,本研究在无菌条件下分别采集饱血、半饱血草原革蜱和森林革蜱中肠内容物,提取细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rRNA V3区,变性梯度凝胶电泳(DGGE)后,切取优势条带纯化、克隆和测序,测序结果与GenBank数据库中已知细菌序列进行比对分析。结果显示,在饱血、半饱血草原革蜱和森林革蜱中肠4个肠内容物样品中共检测到巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌、大肠杆菌、嗜吞噬细胞无形体和斑疹伤寒立克次氏体5种细菌,其中半饱血草原革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌和大肠杆菌;饱血草原革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌和嗜吞噬细胞无形体;半饱血森林革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、大肠杆菌和嗜吞噬细胞无形体;饱血森林革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌、嗜吞噬细胞无形体和斑疹伤寒立克次氏体;4个样品中的共有菌为巴氏立克次体暂定种。研究结果表明,不同蜱种中肠内菌群的结构随吸血时间的延长而发生变化。本研究将为防治草原革蜱、森林革蜱及相关蜱传病提供科学依据。     

微小牛蜱一个抗菌多肽编码基因的克隆和表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究,本研究根据微小牛蜱巴西株报道的一种抗菌多肽核苷酸序列设计引物,从微小牛蜱中国安徽株克隆到该抗菌多肽基因,全长383bp,编码110个氨基酸残基,该蛋白预测的分子量为12.2ku,等电点为4.87.经同源性比较,该微小牛蜱巴西株抗菌多肽基因有100%的相同性.经RT-PCR分析表明,该基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半饱血雌蜱、饱血雌蜱和雄蜱这几个阶段均有表达.将该基因亚克隆到pET-28a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达.重组融合蛋白大小为15ku左右,与预期大小一致.初步体外抗菌试验表明,重组蛋白具有一定的抗菌活性.Western-blot显示,兔抗微小牛蜱唾液抗体能够识别重组表达蛋白.     

微小牛蜱细胞培养技术

微小牛蜱是多种人兽共患的自然疫原性疾病的媒介,蜱细胞培养与细胞系的建立是其分子生物学研究及其传播疾病研究的常用手段.微小牛蜱细胞培养比较适宜的培养基为Grace、Schneider、L15、M119等培养基.论文比较系统地介绍了利用蜕皮前的幼蜱、成蜱卵巢、饱血雌蜱的血淋巴组织等材料体外培养微小牛蜱细胞的试验技术.     

微小牛蜱唾液菌群的PCR-DGGE分析

为了解微小牛蜱唾液内的菌群结构信息,采用PCR-DGGE技术对微小牛蜱半饱血、饱血雌成虫唾液内菌群结构进行了分析和比较,结果表明:微小牛蜱半饱血、饱血雌成虫唾液内菌群结构有较大差异,饱血中细菌比半饱血多两种,分别为莫拉菌和不动杆菌;唾液内菌群与全蜱菌群差异极大。在检出的细菌中多数具有一定的致病性,故微小牛蜱叮咬可能会引起人或动物发生多种细菌性疾病。     

革蜱携带微生物多样性的二代测序技术分析

为了解黑龙江省尚志市某林区革蜱携带微生物种类的特点,试验采集游离蜱,随机取雌雄革蜱各96只,提取蜱足和其他部位的DNA样品分成雌蜱、雄蜱和蜱足3组,分别扩增16S r DNA基因V3~V4区,应用Illumina Hi Seq 2500测序平台进行深度测序,并对微生物多样性进行生物信息学分析。蜱足组代表外环境微生物群,在去除蜱足组所携带微生物的有效序列后,对雌蜱和雄蜱两组革蜱体内的微生物进行具体分析。结果表明:雌蜱和雄蜱两组样品共获得60 954条有效序列,平均序列长度为423 bp,包括651个分类操作单元(OTU),共192个科,309个属;其中检测到25类致病微生物,分别包括布鲁氏菌科、巴斯德氏菌科和分支杆菌属等常见人兽共患病菌,以及考克斯氏体属、立克次氏体属、无形体属、疏螺旋体属和埃立克体属5类蜱传病原;分析发现雌蜱和雄蜱携带的病原种类和丰度均不同,其中雌蜱中蜱传病原的种类多于雄蜱。说明采自尚志市某林区森林革蜱体内的微生物群结构具有多样性和复杂性,雌蜱和雄蜱微生物群的多态性存在差异。     

狼源和羊源长角血蜱体内菌群分析

采用PCR-DGGE技术分析狼、羊长角血蜱体内携带菌群情况。无菌条件下将样品用液氮研磨成粉,试剂盒提取细菌总DNA;通用引物扩增细菌16S r DNA V3区并进行DGGE电泳,分析、选取7条优势条带,回收克隆测序。结果显示,狼、羊长角血蜱体内共携带7种优势菌,其中兰斯格军团杆菌(Legionella lansingensis)、皮可克立克次氏体(Rickettsia peacockii)、RSV70AB1-2细菌(Bacterium SV70AB1-2)、JNCZJb F1细菌(Bacterium JNCZJb F1)为二者共有;不动杆菌属(Acinetobacter sp)和一种不可培养的细菌存在于狼源长角血蜱体内;拉乌尔特立克次氏体(Rickettsia raoultii)存在羊源长角血蜱体内。长角血蜱寄生在不同宿主体内所携带优势菌群存在一定差异。     

不同饱血状态微小牛蜱中肠和唾液菌群结构的分析

旨在探明微小牛蜱随吸血时间的延长,中肠和唾液微生物菌群结构的差异,以及优势菌属在中肠和唾液中增殖和迁移的特点。在无菌条件下采集半饱血、饱血微小牛蜱唾液和中肠内容物;提取细菌总DNA,PCR扩增其16SrDNA V3-V4区,Illumina MiSeq双端测序;对序列进行拼接和过滤、OTUs聚类、物种注释及多样性分析。结果显示,共得到134 317条序列,聚类后获得1 304个OTUs,半饱血雌成蜱唾液(SP)、饱血雌成蜱唾液(SF)、半饱血雌成蜱中肠内容物(MP)、饱血雌成蜱中肠内容物(MF)分别获得336、332、269、289个OTUs,其中152个OTUs为4个样本共有;4个样品在门水平上,以变形菌门和厚壁菌门为优势菌门,变形菌门在中肠中的含量大于唾液,而厚壁菌门反之;在属水平上,4个样本以柯克斯体属、不动杆菌属、甲基杆菌属、短波单胞菌属、立克次体属、埃希菌属为优势菌属,其中柯克斯体属、不动杆菌属在4个样本中含量均较大,柯克斯体属在半饱血状态下,含量高于饱血状态;不动杆菌属在唾液中的含量高于中肠。结果表明,微小牛蜱中肠和唾液中有复杂的微生物菌群结构;细菌在不同组织中的分布不同,其含量随吸血时间的延长而发生变化。     

镰形扇头蜱唾液腺、中肠和卵的菌群结构

采用PCR-DGGE技术分析了镰形扇头蜱雌成蜱中肠内容物、唾液腺、虫卵的菌群结构。无菌条件下采集镰形扇头蜱雌成蜱中肠内容物、唾液腺、虫卵,提取细菌总DNA;以通用引物扩增细菌16SrDNA V3区;DGGE电泳,回收、克隆、测定DGGE优势条带。结果表明,饱血和半饱血雌蜱中肠菌群结构相同,中肠内容物、唾液腺和虫卵部分细菌相同;9条明显条带的序列分别与柯克斯体属(Coxiella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、涅斯捷连科菌属(Nesterenkonia)、共生菌(Symbiotic bacteria)和未培养土壤细菌的16SrDNA V3区序列高度相似。分离到2株细菌,为模仿葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。     

七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净7种药物对未吸血的微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50)。结果显示，所用药物中半数致死浓度最低的3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3．01～3．13、4．37～4．77、11．18～11．36、275．50～276．50mg／L；植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为4．22～4．42、10．30～10．50、82．50～82．70、635．30～636．70mg／L；人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3．42～3，44、7.10～9．06、42．30～42．50、545．50～546．70mg／L。     

湖南省蜱及5种蜱传病原研究

蜱传病呈全球分布，危害人类和动物健康。为了研究湖南省娄底市现存蜱媒病原体，于2021—2022年在湖南省娄底市采集1 395只微小牛蜱样本，提取蜱样品基因组DNA。选取蜱线粒体COI基因扩增特异性的基因片段，对微小牛蜱进行鉴定。为了对该蜱携带的病原进行检测，采用PCR方法对立克次体ompA和gltA基因，无形体groEL和23S rRNA基因，埃立克体groEL和16S rRNA基因，螺旋体16S rRNA和23S rRNA基因进行扩增，对阳性产物进行克隆测序，测序获得的基因序列进行系统发育分析来确定病原的基因型。结果显示，从蜱样本中检测出5种蜱传细菌病原，包括敬信立克次体(Candidatus Rickettsia jingxinensis)、中央无形体(Anaplasma centrale)、扁平无形体(Anaplasma platys)、米氏埃立克体(Ehrlichia minasensis)和宫本疏螺旋体(Borrelia miyamotoi)。其中敬信立克次体、米氏埃立克体和宫本疏螺旋体阳性率均为2.16%,扁平无形体阳性率为0.30%,中央无形体阳性率为5.79%。本研究利...     

溴氰菊酯对微小牛蜱的敏感度和对雌蜱产卵的影响的研究

１９９１～１９９２年在福建省研究溴氰菊酯对微小牛蜱各变态期的敏感度和对饱血雌蜱产卵情况的影响。结果表明，幼蜱对溴氰菊酯最敏感，当施用浓度为５ｐｐｍ时，幼蜱平均死亡率为１００％；若蜱其次，死亡率２８．９％；未吸虫成蜱敏感度最低，死亡率仅１０％。据Ｘ２检验，微小牛蜱在不同变态期间对溴氰菊酯的敏感度差异极显著（Ｐ＜０．０１）。饱血雌蜱接触溴氰菊酯１０μｇ／虫后，其产卵前期比对照蜱延长６天，产卵期缩短６天，产卵量减少２１８８粒。     

唐山地区蜱传斑点热群立克次体分子流行病学

根据已发表的长角血蜱16SrRNA序列及斑点热群立克次体外膜蛋白A（OmpA）基因序列设计2对特异性引物,对唐山地区采集的长角血蜱进行PCR检测,并对阳性样本进行测序和序列分析,抽检样本建立分子系统进化树。结果表明,在315份蜱DNA样本中检测出25份阳性样本,阳性率为7.94%;序列分析结果显示唐山地区长角血蜱携带立克次体同处于一个分支,与日本株立克次体同源性最高（93.30%）,其次是福建株立克次体（92.11%）,黑龙江立克次体绥芬株（90.45%）、虎林株（90.42%）。结论得出唐山地区蜱传斑点热感染较严重,分子进化分析结果显示唐山地区蜱传斑点热群立克次体可能为一新种。     

四种硬蜱的实验室人工饲养和部分生物学特性的观察

为了给蜱及蜱传疾病研究提供充足、有效的实验材料，我们对镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemphysa loides haentaphysaloides)、亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum asiaticum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)和嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)进行了实验室人工饲养。在25℃，92％相对湿度，黑暗条件下．以兔为唯一饲血动物，四种硬蜱均可完成整个生活史的发育。镰形扇头蜱完成一代需86一l20天，亚洲璃眼蜱需l04一l47天，微小牛蜱需50一74天，嗜群血蜱需88一l25天。通过实验室人工饲养，成功进行了单雌蜱蜱群的繁殖。除微小牛蜱外，其他三种蜱均可进行大量增殖。     

关岭自治县某牛场蜱虫病分子诊断及驱虫试验

2017年,关岭自治县坡贡镇某牛场112头关岭牛普遍出现体型消瘦,精神萎靡等症状,经现场诊断为牛蜱病,感染率达100%。为准确鉴定寄生于关岭牛的牛蜱种属,为驱虫提供依据,采用通用引物TITS2-F1/TITS2-R1,扩增牛蜱ITS2基因。对PCR产物进行测序,比对分析,并构建系统进化树。结果显示,ITS2序列长约1 000bp,与微小牛蜱的同源性为99.4%。基于ITS2的种系发育分析表明,关岭牛蜱虫分离株(GLT)与GenBank数据库公布的微小牛蜱位于同一分支。结果表明,该牛场牛群感染蜱虫为牛微小牛蜱。通过注射虫退(伊维菌素),连续治疗35d,病牛得到康复。     

微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析

从微小牛蜱克隆到1个新的铁蛋白编码基因，cDNA全长642bp，编码区为123-639bp，编码172个氨基酸残基，该蛋白预测的分子量为19．9ku，等电点为4．24。经过分析，其预测氨基酸序列与已报道的变异革蜱、非洲钝缘蜱和蓖子硬蜱铁蛋白同源性分别为93．60％、88．37％和83．72％。且核苷酸序列在mRNA 5’未翻译区(5’UTR)的茎环结构存在铁应答元件(IRE)，其氨基酸序列上带有典型的亚铁氧化酶中心结构的保守序列。RT-PCR分析表明，该基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半饱血雌蜱、饱血雌蜱和雄蜱这几个阶段均有表达。     

新疆石河子地区犬源立克次体病流行病学调查

立克次体目(Rickettsiales)中的立克次体属、埃立克体属和无形体属细菌分别能引起立克次体病、埃立克体病和无形体病,硬蜱是其主要传播媒介。在石河子市部分宠物医院及周边地区采集犬血及犬体表寄生蜱,通过PCR技术扩增蜱传立克次体目细菌16S rRNA基因,对所得结果进行测序并做系统进化分析。结果表明,扩增出立克次体345bp特异片段,无形体及犬埃立克体452bp特异片段,测序结果证实这些片段分别为立克次体、无形体和犬埃立克体。遗传进化分析显示,犬源立克次体、埃立克体及无形体石河子流行株分别与Rickettsiales bacterium(EF687768)、Ehrlichia sp.Yonaguni206(HQ697589.1)、Anaplasma(KJ410247.1、KJ410248.1、KJ410249.1)处于同一分支,分别属于立克次体、埃立克体、无形体的保守分支,提示与这些国内外流行株具有较近的亲缘关系。本研究基本理清了石河子地区犬中蜱传立克次体的感染和流行情况,为立克次体的防治提供了流行病学资料。