柑橘类植物GPAT基因片段克隆和SNP分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因是与植物抗冷性强弱密切相关的基因。根据已报道的各种植物GPAT基因的氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从琯溪蜜柚、马家柚、莽山野橘等8种柑橘类植物中克隆得到315bp的GPAT基因片段。使用DNA Star5.0软件对8个片段序列进行同源性比较,8个片段的核苷酸同源性高达97.8%,与其它植物GPAT基因核苷酸序列的同源性都在72.5%以上;经过氨基酸序列推导,每个GPAT基因片段分别编码105个氨基酸,8个片段的氨基酸同源性为95.2%,与其它植物GPAT基因的氨基酸序列同源性在68.9%以上。试验克隆所得8种柑橘类植物GPAT基因片段序列存在明显的单核苷酸变异,在14个核苷酸位点存在SNPs(single nucleotide polymorphisms),导致6个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/22.5bp,核苷酸变异度为4.45%,氨基酸变异度为5.71%。采用NJ聚类法对克隆片段的核苷酸序列进行了遗传多样性分析。     

甘蓝型油菜ADC基因片段的克隆及序列分析

[目的]克隆甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶(ADC)基因的cDNA片段,为进一步获得ADC基因全长及研究其的生物学功能奠定基础.[方法]以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种中双6号的花蕾为材料,设计简并引物,采用同源克隆法扩增ADC基因的cDNA片段.[结果]成功扩增获得8个不同的ADC基因拷贝,按长度将其分为1011、999、981 bp 3类,8个拷贝核苷酸序列之间的同源性为81%~99%,其推导氨基酸序列之间的同源性为86%~99%.1011 bp片段包含3种不同的序列S1 ~S3,序列间存在9个单核苷酸多态性(SNP)位点.999 bp序列包含S4和S5,具有3个SNP位点,两个区段出现连续碱基缺失.981 bp序列包含S6~S8,发现14个SNP位点,且第67位核苷酸出现无义突变,4个区段发生碱基缺失.序列S4~S8共同缺失第632~634、642~650位的核苷酸小片段.氨基酸同源比对和系统进化分析结果表明,8个不同ADC基因拷贝与芥菜(Brassica juncea L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、盐芥(Thellungiella halophila L.)等物种的ADC基因同源性高,亲缘关系近.[结论]所获得的8个基因拷贝即为来自于甘蓝型油菜ADC基因的片段.     

蛇龙珠等酿酒葡萄品种羧酸酯酶基因片段的SNP分析

[目的]利用单核苷酸多态笥(SNP)分析蛇龙珠等酿酒葡萄的单核苷酸多态性及遗传亲缘关系,为今后研究酿酒葡萄的抗性机制以及培育抗病性葡萄提供参考。[方法]以酿酒葡蛇龙珠8个新株系(E01~E08)、品丽珠、赤霞珠为材料,以欧亚种黑比诺为对照,对羧酸酯酶基因(CXEs)片段进行克隆和序列分析,研究蛇龙珠等酿酒葡萄之间的遗传差异。[结果]序列对比显示,该基因片段在编码区和非编码区均存在不同程度的碱基替换。11份葡萄材料的基因片段共发现87个多态性位点,平均74 bp左右的序列长度上能够检测到一个SNP位点,核苷酸多样度(Pi)0.050 76±0.011 49,单倍型多样度(Hd)1.000±0.039,表现出丰富的遗传多样性。3种中性检验方法比较序列变异模式,结果符合中性生化模型。通过聚类分析可将蛇龙珠E02、E03聚为一类,E07、E08聚为一类,其遗传距离和地理距离一致。该序列片段存在一些突变,这些突变能将蛇龙珠8个新株系与其他酿酒葡萄品种明显区分。[结论]CXEs基因片段的突变位点可作为遗传标记,利用SNP方法可分析葡萄的遗传多样性和亲缘关系。     

火龙果Actin及UBQ内参基因片段的克隆及序列分析

为给火龙果的功能基因表达和调控研究提供内参基因,根据Actin基因和UBQ基因的保守区设计引物,采用RT-PCR方法克隆火龙果Actin基因和UBQ基因片段。结果表明:克隆的Actin基因和UBQ基因片段大小分别为302bp、192bp,分别编码100个氨基酸和63个氨基酸。Actin基因片段与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在78%以上,与氨基酸序列的同源性达88%以上;UBQ基因片段与其他植物UBQ基因核苷酸序列的同源性均在88%以上,与氨基酸序列的同源性达95%以上。     

火炬松生长和松脂性状相关候选基因的单核苷酸多样性分析

[目的]对火炬松Pinus taeda生长和松脂产量相关功能基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点进行筛选与分析,为分子标记辅助育种提供技术基础.[方法]利用生物信息学对火炬松cDNA文库进行整理、比对、剪接、注释,挑选出与生长素、赤霉素、细胞分裂素及蒎烯合成相关的非重复序列基因(Unigene)作为候选基因片段,利用MEGA5.0和DnaSP4.0软件对火炬松36个单株的8个候选基因片段进行序列比对和分析.[结果]所测序列总长为5 177 bp,检测到184个SNP位点,平均36.9 bp的基因序列中出现1个SNP位点,其中123个为非同义突变、61个为同义突变SNP位点.核苷酸多态性πa和θw分别为0.020和0.016.对8个候选基因片段内SNP位点进行的连锁不平衡分析显示,随着核苷酸序列长度的延伸,SNP位点的连锁不平衡在基因内部迅速衰退(R2≤0.2).[结论]在火炬松中,基于候选基因内SNP位点间的连锁不平衡作图是可行的.     

基于EST序列的玫瑰EST-SNP位点发掘与分析

[目的]发掘出一批玫瑰SNP候选位点,为进一步开发玫瑰EST-SNP标记及研究玫瑰遗传背景、相关性状的分子标记等打下基础.[方法]从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的dbEST数据库下载27125条玫瑰EST序列,经生物信息学方法分析,发掘玫瑰EST-SNP位点,并对其所在核苷酸序列进行功能注释分析.[结果]对27125条EST进行拼接,共得到3544条重叠群(Contigs),其中有243个Contigs含有SNP候选位点.从中筛选出224个候选EST-SNP位点,其碱基突变类型中转换和颠换的数量分别占SNP候选位点总数的59.8%和27.2%.通过序列比对分析,发现有22个SNP位点来源于蔷薇科植物(与玫瑰同科),其中来源于野草莓的基因最多(8个),另有15个SNP位点所在的EST序列与某些软体动物门物种的基因具有较高同源性.[结论]NCBI中的玫瑰EST数据库数据庞大,足够发掘出大量的SNP标记,使得以EST-SNP对蔷薇科玫瑰等植物进行品种鉴定、分类、遗传多样性分析具有可行性.     

地黄肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

[目的]克隆与分析地黄肌动蛋白基因片段。[方法]根据与地黄相近物种肌动蛋白基因序列的保守区设计兼并引物,通过RT-PCR方法扩增地黄编码区肌动蛋白基因。[结果]扩增片段全长为724 bp,对应编码240个氨基酸。序列比对分析发现其与其他高等植物肌动蛋白基因核苷酸序列同源性在80%以上,氨基酸序列在90%以上。[结论]系统进化分析表明,扩增到的地黄肌动蛋白基因与烟草actin7基因有较近的亲缘关系。     

高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除了69、146、200、234位点处潜在的N-糖基化位点比较保守以外,其余的糖基化位点都出现了变异情况。红细胞结合位点(HB)在431~433位点区域比较保守,但在366~373和399~404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。[结论]江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

基于基因组数据库的杂草稻叶绿体分子标记开发

[目的]杂草稻的起源与演化是一个未澄清的热点问题,分子标记技术是最重要的研究手段之一。由于已经应用的分子标记数量有限,与栽培水稻缺乏特异性,因此探索新的分子标记仍然十分必要。[方法]使用网络基因组数据库中13份栽培水稻和野生稻叶绿体全基因组序列进行比对和分析,针对其中的高频变异区域设计标记引物,进而对60份杂草稻样品的标记区域测序并进行多态性验证。[结果]13份样品叶绿体全基因组中存在1020个单核苷酸多态性(SNP)位点,111个插入/缺失(InDel)位点,表现出丰富的遗传变异;选定其中3个高频变异区域,分别针对trnG-trnfM基因间区、psbM-trnC基因间区和trnT-trnL基因间区设计了3对引物,对60份杂草稻材料进行了检测,发现3个片段总长1966bp,共存在7个SNP位点,6个InDel位点,总变异序列长度为34bp,占序列总长的1.73%。系统发育树结果显示,60份杂草稻被划分为4个类群。另外,将网络数据库中的13份栽培水稻和野生稻数据进行分析,发现不同栽培稻和野生稻的籼粳类型分别被聚到杂草稻的相应类群中。[结论]所开发的3对叶绿体分子标记可以对上述杂草稻进行良好的分类,因此可以作为研究杂草稻遗传多样性及演化的分子标记。     

肇庆地区柑橘内生细菌的分离及初步鉴定

[目的]寻找有效抑制柑橘黄龙病病原菌的拮抗内生菌.[方法]从肇庆地区所属的6个县（市）的柑橘果园中采集24份柑橘植株的枝叶样本,利用平板分离培养方法对其内生细菌进行了分离,并对其进行了鉴定.[结果]从柑橘枝叶样本中共分离得到柑橘内生细菌55株,经显微形态初步鉴定,分属于5个属.[结论]为柑橘黄龙病的防治提供了理论依据.     

气象条件对台州和衢州柑橘生产的影响研究

[目的]比较气象条件对台州和衢州柑橘生长的影响差异。[方法]利用2000~2010年台州市和衢州市的柑橘种植面积和产量,选取常山、龙游、三门、天台这4个亩产较高的城市作为研究对象;引用气象产量这一概念,并运用Pearson相关法分析了4个城市柑橘气象产量与平均气温、降水、日照时数之间的关系。[结果]不同的气象要素在不同生长时期对柑橘的气象产量具有不同的影响。[结论]柑橘的种植要结合各个城市的气象特点,这样才能提高柑橘的产量和品质。     

茶枝柑皮中多糖组成成分的分析

[目的]研究测定茶枝柑皮中多糖的组成成分。[方法]以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行柱前衍生化,采用反相高效液相色谱法,测定茶枝柑皮多糖中单糖衍生物。色谱条件为：色谱柱为Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相为浓度0.05mol/L混合磷酸盐溶液-乙腈（80∶20,V/V,pH=7.1）;检测波长为245 nm。[结果]茶枝柑皮多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成,其摩尔比为0.08∶0.002∶0.05∶4.80∶1∶1.52∶0.11∶3.82。[结论]该方法具有操作简单、快速、重复性好、回收率高等特点,可用于柑橘果胶多糖中单糖组成及含量的测定。     

烯啶虫胺·高效氟氯氰菊酯等6种农药防治柑橘木虱田间药效试验

[目的]筛选速效性好、防效高的防治柑橘木虱药剂。[方法]在柑橘园中采集柑橘木虱成虫,接种放养在柑橘木虱的寄主———芸香科植物九里香上,待繁殖到2~3代后进行喷药试验。[结果]供试6种农药中,农敌落515.00mg/kg对木虱速效性好、持效性长,药后1、3、7、15d的防效都达到100%,药后30d的防效仍达94.5%,杀卵作用强。氯氰·毒死蜱EC477.00mg/kg,甲维·氯·毒死蜱EC479.00mg/kg药后1d的防效都达100%,药后20、30d的防效显著低于农敌落515.00mg/kg;高效氟氯氰菊酯对柑橘木虱成虫防效高,16.67mg/kg药后1、3、7、15d防效都在95%以上。醚菊酯对木虱成虫具有较好速效性,但持效性差。烯啶虫胺AS100.00mg/kg对柑橘木虱的防效差,而且对温度敏感。[结论]氯氰·毒死蜱、甲维·氯·毒死蜱速效性较好,但持效性低于农敌落。高效氟氯氰菊酯防效也较高,醚菊酯有较好速效性,但持效性差。烯啶虫胺的防效差,生产上不宜用来防治柑橘木虱。51.5%增效农敌落对柑橘木虱的防治效果显著,可以很好的防治柑橘木虱。     

砧木品种与茎尖嫁接成活率关系的研究

[目的]明确砧木品种与茎尖嫁接成活率的关系。[方法]分别以枳(Poncirus trifoliata)、枳橙(Ruta"Citrange")和甜橙[Citrussinensis(L.)Osbeck]作为茎尖嫁接砧木,采用倒"T"字法对黄果柑、长泰芦柑、玉环高橙以及玉环柚进行茎尖嫁接脱毒。[结果]黄果柑和玉环高橙用甜橙作砧木成活率最高分别为75.0%和60.0%,长泰芦柑和玉环柚用枳橙作砧木成活率最高分别为46.7%和18.2%。[结论]茎尖嫁接成活率的高低与砧木和脱毒品种的亲和性有关,同一品种选用不同的砧木其茎尖嫁接成活率有差异。     

柑橘气孔性状及开张度日变化规律研究

[目的]为柑橘冬季管理提供理论依据。[方法]以尾张温州蜜柑（Citrus unshiu Marc. cv. Owari）和琯溪蜜柚[C. grandis（L.） Osbeck. cv. Guanxim iyou]为试验材料,测定了叶片不同部位气孔密度、气孔纵径和横径,观测了冬季晴天气孔开张度的日变化。[结果]在所观测的2个柑橘叶片的3个部位中,叶片中部的气孔横径、纵径和气孔密度均比其他部位的要大 琯溪蜜柚的气孔密度比尾张温州蜜柑要小 2种柑橘气孔开张度变化趋势趋于一致。[结论]冬季柑橘应加强田间管理,以保护叶片的正常生理功能。     

柑桔木虱在桂林市的周年发生动态观察

[目的]了解桂林市柑桔木虱周年发生动态,为柑桔木虱的预警及柑桔黄龙病防控提供基础资料.[方法]2007~2010年在失管柑桔园、柑桔木虱寄主植物九里香和正常管理柑桔园观察柑桔木虱周年发生动态及世代重叠情况、不同年份高峰期及种群走势,并分析其危害严重的原因.[结果]桂林市周年有柑桔木虱发生,失管柑桔树及九里香上柑桔木虱种群数量多,下半年高于上半年,且每年有多个峰期,世代重叠;失管柑桔园从21旬开始种群数量剧增,30旬后数量减小,成、若虫高峰期出现在25~29旬;九里香上柑桔木虱主要出现在12~33旬,20旬为最高峰期.正常管理柑桔园柑桔木虱种群数量低,高峰期的33~34旬仅监测到5~30头/100梢.[结论]在桂林市失管柑桔园和绿化植物九里香上周年有柑桔木虱发生,木虱种群数量大,下半年高于上半年,世代重叠;正常管理的柑桔园柑桔木虱种群数量低,管理良好的柑桔园全年未检测到柑桔木虱.     

不同施肥模式对恭城县生态产业园区柑橘生长的影响

[目的]研究不同施肥模式与柑橘养分供给的关系,探索既能平衡供给柑橘养分,又可以减少化肥施用量、提高果实品质和改善土壤理化性状的施肥模式。[方法]以广西恭城县生态产业园区柑橘园内8年生槿柑为试材,设置施肥模式A（全年施肥5次,有机养分：元机养分=1：2）、施肥模式B（全年施肥3次,有机养分：无机养分=4：1）、施肥模式c（对照,全年施肥5次,有机养分：无机养分=1：4．7）。[结果]结果表明,在生理落果末期、幼果膨大期、上水期和收获期,柑橘叶片氮、磷、钾含量3个处理之闻没有明显差异,但施肥模式B与对照相比,土壤有机质含量增加了45．65％,果实可溶性固形物含量增加了3．78个百分点。综合各项指标表明,施肥模式B与其他施肥模式相比。减少了施肥次数和化肥的施用量,并能够保证平衡供给柑橘各个时期的养分需求。[结论]全年施肥3次,有机养分：无机养分=4：1的模式不仅有利于固区土壤肥力和理化性状的改善,而且有利于促进果园生产的可持续发展。     

几种农药防治柑橘蚜虫药效研究

[目的]研究几种农药防治柑橘蚜虫的药效,为柑橘生产提供科学依据。[方法]于无翅蚜为害期喷雾高、中、低3种剂量的阿维菌素、蛇床子素、高效氯氰菊酯和阿维菌素＋吡虫啉（1∶2）,以剂量25mg/kg的吡虫啉为药剂对照,设清水为空白对照,分析几种农药防治柑橘蚜虫的效果。[结果]5种供试药剂中阿维菌素、高效氯氰菊酯、阿维菌素＋吡虫啉及吡虫啉单剂对柑橘蚜虫均有很好的防效,速效性、持效性均接近或超过95%。生物农药蛇床子素低剂量和中剂量处理后1d对蚜虫防效较低,分别为44.14%和69.74%;高剂量药后3d防效开始上升,药后10d防效达94.76%,药后14d防效可达98.87%。5种供试药剂均有很好的持效性,所有处理药后2周的防效均在95%以上。[结论]为柑橘蚜虫的防治提供了借鉴,并有效保证了高毒农药的取代工作。     

柑橘品种茎段离体培养条件的优化及微芽嫁接试验

[目的]优化柑橘品种茎段离体培养条件并开展微芽嫁接(试管内茎尖嫁接)试验,为培育无毒柑橘组培种苗提供参考依据.[方法]对温州蜜柑和纽荷尔脐橙成年态枝条进行不同浓度HgCl2和NaClO消毒,筛选适宜组培利用的柑橘外植体消毒方式、采集季节及激素配比;开展嫁接砧木种子消毒和微芽嫁接试验,分析两个柑橘品种微芽嫁接的萌发状况.[结果]温州蜜柑外植体的最适消毒方法为70%酒精+1.0‰HgCl2消毒6 min处理两次;纽荷尔脐橙外植体的最佳消毒方法为70%酒精+15.0%NaClO处理两次;采集成年态柑橘茎段进行离体培养的最佳时期为夏季;在MS固体培养基中添加1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)和0.1 mg/L萘乙酸(NAA)均有利于两个柑橘品种外植体腋芽萌发.砧木种子最适消毒方法为剥去内外种皮+70%酒精+1.5%NaClO溶液处理;两个柑橘品种微芽嫁接的萌发率较低,分别为10.00%和6.67%,但嫁接成功后柑橘苗长势良好.[结论]于夏季剪取温州蜜柑和纽荷尔脐橙成年态枝条带芽茎段,分别经70%酒精+1.0‰HgCl2消毒6 min处理两次、70%酒精+15.0%NaClO处理两次,在添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的MS固体培养基中接种,可获得最佳的培养效果.利用微芽嫁接技术嫁接的柑橘苗长势良好,可在提高其嫁接萌发率基础上推广应用.