利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花

为获得具有无选择标记的转基因菊花,构建了一个双T-DNA超级双元载体pCAMBIA1301-gus,其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因gus,而且两个T-DNA结构顺序相连,中间没有其他插入序列.利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞,共获得506个抗性植株,通过PCR和Southern杂交检测表明共转化率为38.4%,对其中17个同时整合了hpt和gus基因的植株自交获得的T1代株系进行检测,发现约有15.8%的T1代植株中不含选择标记基因hpt,结果表明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物.     

番茄育种后代Mi抗性基冈植株的筛选

根据已报道的番茄抗根结线虫病Mi基因的CAP标记设计引物,通过微量DNA提取方法提取番茄叶片的DNA.在优化DNA提取方法和PCR反应条件的基础上,对番茄育种后代共306株试材进行抗性标记筛选鉴定。其中264株无PCR扩增产物,即无抗根结线虫病基因位点,其余42株均产生了750 bp的特异片段,即具有抗根结线虫病基因的位点。利用CAP标记,经TaqI酶酶切,有3株产生了570 bp和160 bp二条特异带,为抗性纯合体;8株产生了750 bp,570 bp,160 bp三条特异带,为抗性杂合体。31株不能被TaqI酶消解,只有未消解前750 bp一条带,为感病植株。     

番茄育种后代Mi抗性基因植株的筛选

根据已报道的番茄抗根结线虫病Mi基因的CAP标记设计引物,通过微量DNA提取方法提取番茄叶片的DNA,在优化DNA提取方法和PCR反应条件的基础上,对番茄育种后代共306株试材进行抗性标记筛选鉴定.其中264株无PCR扩增产物,即无抗根结线虫病基因住点,其余42株均产生了750 bp的特异片段,即具有抗根结线虫病基因的位点.利用CAP标记,经TaqI酶酶切,有3株产生了570 bp和160 bp二条特异带,为抗性纯合体;8株产生了750 bp,570 bp,160 bp三条特异带,为抗性杂合体.31株不能被TaqI酶消解,只有未消解前750 bp一条带,为感病植株.     

番茄灰叶斑病抗病基因Sm分子标记的建立

以抗病纯合体(Sm/Sm)、抗病杂合体(Sm/sm)和感病纯合体(sm/sm)番茄为试验材料,以提取的基因组DNA为模板,根据与抗病基因Sm紧密连锁的RFLP标记设计特异引物进行PCR扩增,对扩增产物进行序列分析寻找酶切位点,采用限制性内切酶酶切的方法,创建新的与番茄灰叶斑病抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记,以期为今后番茄抗病育种工作提供技术支撑。结果表明:创建的T050标记稳定、可靠,是一个共显性分子标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。     

与番茄灰叶斑病抗病基因Sm连锁的CAPS标记开发

利用与番茄灰叶斑病Sm基因连锁的RFLP标记,设计开发了一个CAPS标记,用于抗番茄灰叶斑病育种。以已知抗病基因型的番茄种质为材料,参照与Sm基因紧密连锁的RFLP标记设计特异引物,进行PCR扩增,产物克隆测序分析寻找特异性酶切位点,开发了一个与抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记,命名为T280。利用特异引物T280进行PCR扩增,供试材料均扩增出1条655 bp的特异条带。经限制性内切酶Mme I酶切后,抗病纯合材料仍保留1条655 bp的特异条带,感病纯合材料产生206 bp和449 bp的特异条带,抗病杂合材料产生206 bp、449 bp和655 bp的特异条带。利用不同遗传背景的番茄材料对该标记进行验证,结果发现,能够区分抗病杂合、抗病纯合和感病纯合材料。开发的CAPS标记稳定可靠,是一个比较理想的共显性CAPS标记,可用于Sm基因的分子标记辅助育种。     

番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 TY-1的 PCR 检测

利用特异引物对3份抗病纯合材料(基因型Ty-1/Ty-1)和4份感病纯合材料(基因型ty-1/ty-1)进行PCR扩增,抗、感材料均产生398bp的PCR扩增片段,抗病和杂合抗病材料的酶切产物存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303和98bp以及398、303和98bp的片段,而纯合感病材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为398bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及抗病杂合材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对13份番茄杂交种进行检测,有8份杂交种含有Ty-1抗病基因,3份材料不含Ty-1抗病基因。利用这条标记对国内的13份番茄自交系进行检测,13份材料均不含Ty-1抗病基因。     

番茄抗病基因Ty-1的CAPS标记及检测

为了获得番茄抗病基因Ty-1的分子标记,利用特异引物对3份抗病纯合材料（基因型Ty-1/Ty-1）和3份感病纯合材料（基因型ty-1/ty-1）进行PCR扩增,抗病、感病材料均产生400 bp的PCR扩增片段,感病和杂合抗病材料的酶切产物存在RsaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了350、50 bp以及400、350、50 bp的片段,而抗病纯合材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为400 bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对33份番茄F1进行检测,有20份材料含有抗病基因Ty-1,13份材料不含抗病基因Ty-1。利用该标记对国内的24份番茄自交系进行检测,24份材料均不含抗病基因Ty-1。经反复验证,结果准确可靠,该标记可以用于对番茄抗病基因Ty-1的筛选鉴定。     

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花的研究

为获得具有无选择标记的转基因菊花,构建了一个双T-DNA超级双元载体pCAMBIA1301-gus,其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因gus,而且两个T-DNA结构顺序相连,中间没有其他插入序列。利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞,共获得506个抗性植株,通过PCR和Southern杂交检测表明共转化率为38.4%,对其中17个同时整合了hpt和gus基因的植株自交获得的T1代株系进行检测,发现约有15.8%的T1代植株中不含选择标记基因hpt,结果表明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物。     

番茄无选择标记转化体系的研究

以含多毛番茄GGPS 基因的表达载体pBI121-GGPS 和无标记载体pBINMF-GUS 为基础,利用载体pBINMF-GUS 的T-DNA 区无选择标记基因的特点,将目的基因GGPS 连接于pBINMF-GUS 的T-DNA 中,用农杆菌菌株EHA105、C58 介导转化番茄品种中蔬6 号,利用PCR 直接筛选转化体。结果表明：MS+1.0 mg·L^-1 ZT+0.5 mg·L^-1 IAA 为子叶最佳芽诱导培养基,农杆菌菌株EHA105 更利于中蔬6号的转化,获得阳性植株4 株,转化率为3.6%。PCR 及RT-PCR 检测结果表明：目的基因已整合到中蔬6 号基因组中,且在转录水平上得到表达。     

抗黄萎病基因StVe转化番茄的研究

 为了验证克隆自水茄（Solanum torvum Swartz）的StVe基因功能,将StVe连入中间载体p35S-2300::gus::noster的BamHⅠ和SacⅠ位点,取代gus基因构建植物双元表达载体p35S-2300::StVe::noster;用农杆菌介导法转化樱桃番茄22号获得了72株卡那霉素抗性植株,PCR和Southern blot检测确认有5株为阳性植株;RT-PCR结果显示,StVe在转基因番茄植株间的转录水平表达存在差异;PDA平板抑菌实验显示,转StVe基因番茄叶片总可溶蛋白具有抑制番茄黄萎病菌生理小种1（Verticillium dahliae race 1）生长的作用。     

甘露聚糖酶与番茄果实硬度的关系

摘　要：本试验采用逆转录法从番茄品种Micro-Tom的成熟果皮中分离得到LeMan4基因,构建了LeMan4反义基因的植物表达载体pBI121-RLeMan4,并通过根癌农杆菌EHA105将其转化番茄,根据NptⅡ序列对抗性植株进行PCR和Southern检测分析,并进行了转基因植株的生理检测。结果表明,NptⅡ序列已整合到番茄基因组中,各转基因植株果实的甘露聚糖酶活性被抑制在12.2 %以下,果实硬度比对照高,但果实都能够成熟和软化,这说明甘露聚糖酶活性与果实软化有关,但却不是番茄果实成熟软化的必要因子。     

拟南芥At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化

 MicroRNA828（miRNA828）是一种新近发现的生物学功能还未全面研究的miRNA。为从 不同角度阐明miRNA828 的生物学功能,从拟南芥中克隆到At-pri-miR828 基因并构建了该基因过量表达 的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828,通过农杆菌介导的叶盘法将pC2300-pOT2-At-pri-miR828 导入异源植物番茄品种‘Ailsa Craig’中。PCR 鉴定结果显示,外源基因At-pri-miR828 已成功整合到转 基因番茄基因组中,共获得9 个转基因株系,67 株转基因植株。定量PCR 检测结果显示,与野生型番茄 植株相比,转基因植株中miR828 的表达量显著增加,而生物信息学所预测的miR828 靶基因Sly-myb-like1 的表达水平则相应降低。花青素含量测定结果显示,miR828 过量表达的转基因番茄植株花青素含量明显 低于野生型植株,表明miR828 参与了番茄花青素的生物合成调控。     

阔叶猕猴桃遗传转化技术参数的优化

为了提高阔叶猕猴桃的遗传转化效率,以阔叶猕猴桃叶柄为试材,通过根癌农杆菌介导法进行了遗传转化技术参数的研究。结果表明,叶柄预培养3～4d、用农杆菌悬浮液(D600nm值0.5)感染10min、共培养48h、共培养时在培养基中加入200μmol/L乙酰丁香酮处理可以获得较高的gus基因表达率。在供试的1200个叶柄中获得了49个抗性芽,转化频率为4.1%。对转基因抗性材料进行PCR检测和gus基因组织化学染色,证实了外源基因已整合到阔叶猕猴桃的基因组中,并得到稳定表达。     

番茄LeEIL1基因表达工程菌的构建及表达分析

 以番茄果实为材料,通过RT-PCR扩增出番茄leEIL1基因,并构建了3种表达载体。表达结果比较分析表明,在以pPIC9k为表达载体,KM71毕赤酵母为宿主细胞的真核表达体系中,LeEIL1蛋白质的表达结果明显优于在以pET30a和pET15b为载体,BL21（DE3）plyss大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系中的表达结果。     

番茄AP2/ERF超家族重鉴定及过表达SlERF.D.3株系表型分析

基于番茄基因组数据库的更新，系统地对番茄AP2/ERF超家族成员进行了更新，并对其进行了染色体定位、保守基序、基因结构和对灰霉菌及生长素胁迫响应的分析。共鉴定出141个ERF家族基因，其中新鉴定出的ERF亚家族成员42个；随机分布在12条染色体上，大都只含有外显子而无内含子，部分基因不同程度的受到灰霉菌和生长素处理的诱导表达。作为拟南芥AtERF109在番茄中的同源基因，SlERF.D.3的表达可被灰霉菌抑制且可迅速强烈地响应生长素处理。为进一步明确SlERF.D.3的生物学功能，以番茄‘Ailsa Craig’为材料克隆了此基因的编码区，构建过表达载体并转化番茄，获得了3个T0代过表达株系。与野生型相比，转基因株系的叶片较细长、向下卷曲，且果实出现乳状突起。这为研究SlERF.D.3在调节番茄的生长发育和胁迫响应过程中的作用奠定了基础。     

超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究

利用重组PCR 技术,将草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因crtB 与豌豆质体定位序列ts-rbcS 融合,插入质粒载体PMV 中,构建了植物表达载体pBI-ts-rbcS-crtB,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄。PCR 检测、Southern 杂交和RT-PCR 分析表明,外源基因crtB 已整合到番茄基因组中,并在转基因植株中得到表达。转基因番茄果实中的类胡萝卜素总量增加1.3 ~ 2.5 倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素分别增加了4.3、1.8、2.2 和2.3 倍。转化株系中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。crtB 基因过量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。     

草菇基因枪法遗传转化体系的建立

 草菇菌株V1308对潮霉素、卡那霉素、遗传霉素、膦丝菌素的抗性测验结果表明, 该菌株对潮霉素敏感, 而对其它三者不敏感。进一步测定结果显示, 潮霉素的最低筛选浓度在PDSA固体培养基上为75 μg·mL ^{- 1} , 在PDSB液体培养基中为50μg·mL ^{- 1}。以含有35S启动子、gus报告基因、潮霉素抗性基因的质粒pCAMB IA1301为表达载体, 采用基因枪法对草菇菌丝体进行遗传转化。结果表明, 基因枪的最佳轰击参数为: 氦气压力1 100 Psi, 真空压力87.88 kPa, 靶距离6 cm, 轰击次数1次。Southern杂交结果显示, gus基因已整合进V1308基因组中。GUS组织化学检测结果证明, gus基因在V1308菌丝体中获得了表达。草菇出菇试验结果显示, 转基因草菇和对照都能正常形成子实体, 子实体组织分离长出的菌丝体经GUS组织化学检测, 证明了外源基因gus能够在转基因草菇的菌丝体中稳定表达。