基于线粒体基因间区的烟草黑胫病菌遗传多样性研究

为了探索云南省主要植烟区的烟草黑胫病菌遗传多样性情况,本研究分析了其线粒体基因间隔区trn Y/rns的序列片段,将26个菌系确定为6种单倍型。基于单倍型构建系统进化树,可将分布于云南省26个县区的分离菌系分为两个明显的组群,其中一个组群包含25个不同地区的菌株,表明云南省烟草黑胫病菌总体遗传分化水平较低。     

烟草黑胫病发生动态与黑胫病菌全基因组(DNA)遗传分化关系的研究

 为了检测烟草黑胫病发生动态与寄生疫霉 (Phytophthora parasitica var. nicotianae )全基因组 (DNA )遗传分化的关系 ,从 12 0个 RAPD(Random Am plified Polym orphic DNAs)随机引物中筛选出启动性强的 14个引物 ,借助于 PCR技术对不同年份同一烟草品种上分离获得的 30个菌株 (10个 /年 )和 5个不同烟草品种上分离获得的 15个菌株 (3个 /品种 )进行全基因组 DNA扩增片段指纹图谱及其遗传分化分析。利用 UPGMA(Unweigthted Pair- groupMethod with Arithm etic Average)软件对受试两组菌株的遗传分化构建遗传进化树 ,结果表明大多数不同年份烟草黑胫病菌株的遗传分化与黑胫病发生危害程度成正相关 ,不同烟草品种上的黑胫病菌株遗传分化与其寄主品种无相关性     

河南和河北冬小麦区假禾谷镰孢的遗传多样性

【目的】运用ISSR-PCR技术揭示中国河南和河北省冬小麦区6个地理群体小麦茎基腐病优势病原菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）的遗传多样性。【方法】利用筛选的17个ISSR引物对从河南和河北冬小麦区收集的166株假禾谷镰孢菌株进行扩增。根据群体扩增的结果,用POPGENE version l.32软件计算各项遗传多样性参数。根据不同地理群体的遗传相似系数,用NTSYSpc version 2.11软件进行群体聚类分析。【结果】从97个ISSR引物中筛选出了17个多态性较好的引物,用这17个引物对河南和河北冬小麦区的166株假禾谷镰孢菌株进行扩增,共扩增出234个DNA片段,其中多态性位点为218个,占总扩增片段的93.16%。平均每个引物可以扩增出13.76个条带,扩增产物大小在150-2 500 bp。POPGENE分析表明,6个地理群体的多态位点数在58-208,平均为124;多态位点百分率在24.79%-88.89%,平均为52.92%;有效等位基因数在1.1548-1.3293,平均为1.2584。遗传多样性分析表明,在地理种群水平上,Nei’s基因多样性指数在0.0897-0.2069,平均为0.1548;Shannon’s信息指数在0.1337-0.3257,平均为0.2368,这表明不同地理群体间存在一定的遗传变异。河南北部地区的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数最高,表明该地区假禾谷镰孢菌株之间的遗传多样性最丰富。河南南部地区的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数最低,表明该地区假禾谷镰孢菌株之间的遗传多样性最低。遗传相似性分析证明,河南北部地区假禾谷镰孢种群和河南东部地区种群最近,河南南部地区假禾谷镰孢种群和河南东部地区种群最远。6个地理群体间的遗传分化系数Gst为0.1571,群体内为0.8429,群体内多样性大于群体间的多样性。6个地理群体间的基因流Nm为2.6819,说明不同地理群体假禾谷镰孢菌株间存在较大的基因流动。6个地理群体总基因多样度Ht为0.1837,各地理群体内基因多样度Hs为0.1548,地理群体间基因多样度Dst为0.0289,这说明相同地理来源的菌株有具有较近的亲缘关系。在遗传相似系数为0.966时,可将6个地理群体划分为2个不同的类群。第Ⅰ类群包括河南北部、河南东部、河南中部、河北中部和河南西部地区,河南南部地区属于第II类群。【结论】河南和河北冬小麦区小麦茎基腐病假禾谷镰孢6个地理群体之间的遗传分化与其地理来源之间有一定的相关性,群体内多样性大于群体间,不同地理群体假禾谷镰孢菌株间存在较大的基因流动。     

基于SSR标记的贵州水稻纹枯病菌遗传多样性

【目的】探明贵州省水稻纹枯病菌群体遗传结构的组成与分布,为水稻纹枯病防控措施的制定提供依据。【方法】采用11个SSR荧光标记对源自贵州9个地区的277株水稻纹枯病菌进行检测,利用POPGENE32计算其遗传参数,NTSYS软件构建系统发育树,GenAlEx软件进行AMOVA方差分析。【结果】共检出92个等位基因,等位基因数、有效等位基因数、Shannon’s信息指数香农指数和Nei’s基因多样性指数的平均值分别为8.363 6、2.277 7、1.064 6和0.510 2,铜仁地区水稻纹枯病菌群体的遗传多样性稍高于其他地区。分子方差分析表明,省内水稻纹枯病菌遗传变异主要是由不同地区群体内菌株间差异引起,占比91%。地区菌株群体间遗传分化程度不一,变幅为0.028～0.176。基于Nei’s遗传相似系数的聚类表明,贵州省水稻纹枯病菌可划分为2个主体类群和7个小类群,遗传多样性较为丰富,但与地理来源关系不明显。【结论】贵州水稻纹枯病菌具有较高的遗传多样性,不同地区间病菌群体间遗传多样性存在差异,其遗传分化主要来源于地区内菌株间,贵州省水稻纹枯病菌聚类为较明显的主体类群和小类群,不同群体的遗传分化及菌株间的亲缘关系与地理来源不明显。     

北方一作区马铃薯早疫病病菌群体SSR遗传结构分析

为明确北方一作区马铃薯早疫病病菌不同地理群体的遗传结构,利用5对简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)引物对河北、黑龙江、辽宁、内蒙古和宁夏5个省(自治区)的74株马铃薯早疫病病菌进行遗传多样性分析。共检测出26个等位基因,45个基因型,每对引物的等位基因数为3～7个,平均为5. 2个。分析结果显示,5省(自治区)的早疫病病菌菌株群体之间相似度都很高,处于0. 900 6～0. 988 9之间。相较而言,河北群体和辽宁群体的亲缘关系较近,内蒙古群体和黑龙江群体的亲缘关系较近,宁夏群体单独为1个分支,表明SSR基因型与菌株的地理来源有相关性。研究还发现,在被测的45个基因型中,仅出现1次的基因型有37个,占82. 2%,说明群体遗传多样性高,推测是准性生殖和人类介导的基因流动共同作用的结果。     

40株尖镰孢菌SRAP遗传多样性分析

[目的]明确尖镰孢菌种内遗传多样性与亲缘关系为尖镰孢菌的分类鉴定及该类病害综合防控提供理论依据。[方法]本试验利用筛选出的12对SRAP引物,对40株尖镰孢菌进行PCR扩增,用POPGENE Version 1.32软件计算遗传多样性参数,用NTSYS-pc Version 2.10s软件对供试菌株进行聚类分析与主成分分析。[结果]共扩增出125个谱带,多态性位点比例达100%,平均每对引物产生多态性条带10.4条。供试菌株的平均Nei's基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.1 876和0.3 139。晋中地区菌株的Nei's基因多样性指数和Shannon's指数均最大(0.172,0.2876),遗传分化水平最高,多样性最丰富。地理群体间遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm)分别为0.3 106、1.1 098,省内3个居群间的遗传距离较其与河北居群间的遗传距离近,表明4个尖镰孢菌群体间存在一定的遗传分化,群体内遗传多样性大于群体间的多样性。地理群体间遗传距离与地理距离存在一定的相关性。聚类与主成分分析结果表明,菌株SRAP类群划分与其寄主和地理来源没有明显相关性。[结论]供试尖镰孢菌遗传分化明显,但亲缘关系相对较近。     

甘肃河西走廊苹果蠹蛾种群遗传分化研究:基于COI基因序列分析

【目的】揭示河西走廊苹果蠹蛾不同地理种群间的联系,分析地理种群间的序列变异、遗传多样性和遗传分化。【方法】采用PCR和基因测序技术,扩增并分析了河西走廊8个地理种群132个苹果蠹蛾个体的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段,应用DnaSP 5.10计算单倍型多样性指数(Hd)、核甘酸多样性指数(Pi)和Tajima’s D值,采用ZT软件包进行Mantel检验,分析种群间遗传距离与地理距离的相关性,利用软件Arlequin 3.11计算成对种群间的固定系数(Fst)。【结果】在获得的132条序列中共发现了8个变异位点和5个单倍型,其中3个单倍型为种群共享单倍型。总体单倍型多样性指数为0.578,种群内单倍型多样性为0.000~0.700。各种群的Tajima’s D值中性检验符合中性突变,说明河西走廊苹果蠹蛾在历史上没有出现群体扩张,群体大小稳定。Fst值表明,河西走廊苹果蠹蛾种群间具有一定程度的遗传分化,而各地理种群的遗传距离与地理距离无显著的相关性。【结论】河西走廊苹果蠹蛾遗传多样性较低,且地理种群间有一定程度的遗传分化。     

内蒙古马铃薯晚疫病菌基因型多样性分析

为了解和探讨我国内蒙古马铃薯晚疫病菌的基因型多样性,对1997～1999年和2002～2003年采自内蒙古马铃薯主栽区的40个马铃薯晚疫病菌株进行了线粒体DNA单倍型和AFLP分析。结果表明,所有马铃薯晚疫病菌株的线粒体DNA单倍型均为Ⅱa型,说明Ⅱa型可能是目前内蒙古马铃薯晚疫病菌的主要类型,同时病菌群体结构为新的群体结构;所有供试的40个马铃薯晚疫病菌株可划分为17种AFLP基因型,平均每2个菌株为1个特有的基因型,17种基因型分布于3个组中,菌株的亲缘关系与病菌的地理来源、采集年份无相关性。     

凉山州烟草黑胫病菌生理小种的鉴定

为了解凉山州烟草黑胫病病原的生理分化情况,对2011年采自凉山州5个地点50个烟草黑胫病菌株采用鉴别寄主法进行生理小种类型的鉴定,结果表明:50个菌株中有0号、1号生理小种,其中0号生理小种占30％,1号生理小种占70％.可见,1号生理小种为凉山州5个县市烟草黑胫病菌的优势小种.     

陕西关中地区苹果褐斑病菌遗传多样性分析

为了揭示苹果褐斑病菌(Diplocarpon mali)的群体遗传多样性,利用ISSR分子标记技术,通过ISSR-PCR扩增,对分离自陕西省关中平原7个县(区)的64个菌株进行遗传多样性分析。结果显示,陕西关中地区苹果褐斑病菌的遗传多样性丰富,不同县(区)病菌的遗传多样性存在差异,渭南市白水县病菌的遗传多样性水平相对较高,咸阳市乾县相对较低。群体之间的遗传分化系数不同,遗传变异主要发生在群体内;不同地区群体之间存在不同程度的基因交流,其中关中中部群体的基因交流更广泛;关中东部、中部、西部地区之间的群体也存在基因交流,其中东部和西部之间群体的基因交流更频繁。NTsys聚类结果表明,种群之间的遗传亲缘关系与分离株的地理来源没有明显的相关性。     

葡萄风信子黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

以葡萄风信子‘亚美尼亚’的根、茎、叶、花为材料,采用RT-PCR技术克隆得到一条FLS基因,命名为MaFLS2。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长为1 152 bp,含有完整的开放读码框1 056 bp,编码353个氨基酸,MaFLS2蛋白是一种亲水性蛋白,氨基酸序列含有典型的DIOX_N结构域(2-酮戊二酸-双加氧酶活性的N端区域)和2OG-FeII_Oxy超家族结构域,属于2-酮戊二酸-双加氧酶(2-ODDs)蛋白家族。实时定量PCR结果显示,MaFLS2基因在蓝白葡萄风信子中的表达存在组织特异性,蓝色品种‘亚美尼亚’中在花蕾未着色时表达量最高,而白色品种‘白丽人’在根中表达量最高, 在花发育的不同阶段,MaFLS2基因在‘亚美尼亚’中的表达峰值出现在花蕾未着色时期,基因表达总体呈现出先降低后升高再降低的趋势,而在‘白丽人’中的表达峰值出现在转色中期,总体呈现出先升后降的趋势。研究结果为开展单子叶植物花色育种提供了理论依据。     

鸡胚NANOG、POUV和TWIST2基因不同发育阶段表达谱分析

为了解析鸡胚发育过程中NANOG、POUV和TWIST2基因的调控作用,利用荧光定量RT-PCR方法,研究NANOG、POUV和TWIST2基因在孵化1~6d(E1~E6)的整体胚胎和孵化15和18d(E15、E18)鸡胚的大脑、心脏、肝脏和左侧大腿肌肉组织中的表达谱。结果表明,1)NANOG基因的表达水平在E2~E6整胚和E15、E18胚期的大脑、心脏、肝脏和腿肌中的表达水平均极显著低于E1时期(P0.01)。2)在鸡胚发育的整胚E1~E6和E15、E18时期的大脑、肝脏、心脏和腿肌中,POUV基因的表达水平基本呈现逐渐降低趋势,且从E3时期后均显著低于E1时期(P0.05或P0.01)。3)TWIST2基因在E1~E6整胚中的表达水平呈现逐渐增高趋势,到E6达到最高水平(P0.05或P0.01);在E15和E18时期的上述4种组织中又呈现降低趋势,但均高于E1时期。NANOG、POUV和TWIST2基因在鸡胚发育过程的调控水平存在差异,研究结果可望为鸡的育种和临床研究提供资料。     

alfAFP和spCEMA融合基因表达载体的构建及其对小麦的遗传转化

以小麦品种西农1376为受体,利用Overlapping PCR的方式构建了防御素基因alfAFP和抗菌肽基因spCEMA融合基因的表达载体,与pAHC20共转化幼胚愈伤组织,获得转基因再生T0代植株269株,春化后移栽成活188株。对叶片基因组DNA进行目的基因和bar基因PCR扩增表明其中7株是共整合植株,共整合频率为0.1%,初步证明融合基因已成功通过共转化方式导入受体小麦品种中。影响共整合率的因素分析表明,在使用除草剂PPT对bar基因进行筛选的过程中,筛选时间的缩短并不会明显降低筛选的效率。     

合浦珠母贝Pf-Cnot2基因的克隆与表达分布

采用RACE技术从合浦珠母贝外套膜组织中克隆得到了CCR4-NOT复合体第二亚基(Cnot2)基因,命名为PfCnot2。该基因全长2 616 bp,开放阅读框为1 725 bp,编码574个氨基酸,理论分子量为61 ku,理论等电点为6.25。蛋白序列分析表明它富含丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸,具有保守的NOT2_3_5结构域。系统进化分析显示Pf-Cnot2蛋白与脊椎动物的Cnot2蛋白进化关系较远。Pf-Cnot2在合浦珠母贝的外套膜边缘、外套膜缘膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃等组织中均有表达,在生殖腺中表达量最高。该基因从担轮幼虫期至幼贝期均有表达,担轮幼虫期表达量最少,D型期比担轮幼虫期有显著增高。上述研究结果为进一步了解Pf-Cnot2在合浦珠母贝中发挥的作用提供了基础数据。     

甜樱桃黄酮醇合酶基因的克隆及其表达分析

为了解黄酮醇合酶在甜樱桃类黄酮生物合成途径中的作用,根据其他物种已知的FLS cDNA保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE的技术,从甜樱桃(Prunus avium.L)嫩叶中扩增获得FLS cDNA全长,命名为PaFLS(GenBank登录号:JQ289290).该基因cDNA全长为1 077 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,分子质量为38 ku,等电点pI为5.58.生物信息学分析表明PaFLS属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy),该基因所编码的氨基酸序列与苹果、梨和草莓的同源性分别为99％、97％和77％.将该基因重组到表达载体pGEX4T-1中进行原核表达,电泳检测到一条约为65 ku的融合蛋白(含27 ku的GST标签).组织时空表达分析表明,PaFLS在甜樱桃的花中表达量最高,这可能和黄酮醇参与花粉萌发及利于授粉有关.     

棉花GhPME1和GhPME2基因的克隆及表达分析

本研究旨在对棉花来源的果胶甲酯酶基因进行克隆和功能分析。通过RACE技术克隆了2个棉花果胶甲酯酶基因的cDNA,命名为GhPME1和GhPME2。序列分析发现:GhPME1和GhPME2的最大开放阅读框分别为1 704和1 752bp,分别编码含有567和582个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构预测显示这2个蛋白结构相似,包含PMEI和Pectinesterase结构域。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示在陆地棉的纤维发育过程中,GhPME1和GhPME2的表达峰值分别在9和4DPA(开花后天数),然后依次降低。而在海岛棉纤维中,这2个基因的表达均呈现逐渐上升的趋势,表达峰值分别出现在开花后24和29DPA。GhPME1和GhPME2在海岛棉和陆地棉棉纤维中的表达差异初步证明该基因家族的功能可能与棉纤维品质相关。     

禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因N端区的克隆与表达

为探讨禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的生物学功能,本实验根据禽类鹦鹉热嗜性衣原体Cal-10株全基因序列设计引物,用PCR法扩增禽嗜性衣原体PmpD基因N端区,将特异性目的基因片段克隆入PBS-TII载体,经测序后确认为目的基因,并提交GenBank。试验扩增的禽鹦鹉热嗜性衣原体Cal株PmpD基因与禽鹦鹉热衣原体6BC株的PmpD基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与流产衣原体成员嗜流产衣原体S26/3株、嗜豚鼠衣原体(GPIC)、嗜猫衣原体(Fe/C-56)核苷酸相似性分别为89%、82%和77%。PmpD基因N端区基因亚克隆到pET-32a(+)载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果表达了约63 ku大小的融合蛋白;分别用禽鹦鹉热嗜性衣原体多克隆抗体、猪、羊流产嗜性衣原体多克隆抗体与表达出的重组蛋白进行Western blotting检测,结果表明该蛋白与禽源衣原体多克隆抗体呈阳性反应,与猪、羊源衣原体多克隆抗体呈阴性反应,显示该重组蛋白具有种属特异性。本研究首次表达了禽类鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的N端区的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能提供依据。     

草莓转录因子基因FaGAMYB的克隆与表达分析

为研究FaGAMYB基因在草莓成花诱导和花发育中的作用,以‘卡姆罗莎’草莓(Fragaria×ananassa Duch.‘Camarosa’)为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术分离了一个赤霉素信号途径中的MYB转录因子基因FaGAMYB。该基因开放阅读框为1 689bp,编码562个氨基酸。序列分析发现FaGAMYB蛋白含有高度保守的R2R3DNA结合域,以及GAMYB基因家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域。亚细胞定位研究发现FaGAMYB蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞核。FaGAMYB基因具有组成型表达特性,但在雄蕊、花芽、茎尖生长点和果实等生殖生长组织与器官的表达丰度较高。在草莓成花诱导期,茎尖中FaGAMYB基因表达上调,当进入雄蕊原基分化期后,该基因表达量迅速升高。上述结果表明FaGAMYB可能在草莓成花诱导和雄蕊发育中发挥重要作用。     

沙柳SpsNAC042基因克隆及逆境表达分析

采用同源克隆的方法获得沙柳SpsNAC042基因，通过生物信息学分析、组织特异性表达分析、逆境表达分析。结果表明，SpsNAC042基因的开放阅读框序列长度为900 bp，共编码299个氨基酸，测定为亲水性不稳定蛋白。组织特异性表达分析得出花中的基因相对表达量最高，幼叶、茎9~15节间、根、成熟叶的表达量依次降低，茎尖的表达量最低。SpsNAC042基因在干旱处理下与对照组相比整体呈增长趋势，并在8 h处达到最高；在低温处理下，基因表达量迅速积累，在2 h处达到最高，然后维持在较低水平表达；在盐和高温处理下SpsNAC042基因缓慢积累，后期迅速增高，最终在24 h处达到最高。研究表明SpsNAC042基因参与逆境应答反应，为深入开展沙柳NAC基因对生物和非生物胁迫应答研究提供了参考价值。     

甘蓝纤维素合成酶基因BoCesA的克隆与序列分析

为研究甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因在干旱胁迫下的表达模式,通过同源克隆得到甘蓝纤维素合成酶基因的cDNA全长,利用生物信息学软件分析该基因的特征;构建含BoCesA和GFP的融合表达载体,通过基因枪转化洋葱表皮细胞试验对该基因进行亚细胞定位;利用荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达情况及干旱胁迫下的表达模式。甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因的cDNA全长为2 721bp,编码906个氨基酸,在N端含有锌指结构域和2个跨膜区,C端含有6个跨膜区,除包含植物纤维素合成酶基因共有的保守区外,还包含2个高突变区。通过氨基酸序列比对分析,发现甘蓝的该基因与拟南芥的AtCesA3基因同源性较高。亚细胞定位表明BoCesA基因初步定位于细胞质膜上。荧光定量PCR分析表明该基因在叶中的表达量高于茎和根中的表达量,在NaCl、PEG处理下BoCesA表达量呈现先升高后下降的趋势。通过对甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因在NaCl、PEG胁迫下的表达分析,预测该基因对干旱胁迫有响应,它的表达受干旱胁迫的影响,这为进一步研究基因功能奠定了基础。