犬精液冷冻与AI的研究报告Ⅰ——用炸熏法冷冻颗粒精液的试验

采集6条公犬的浓伤精液各5或6次,分别将每次采得的精液稀释平衡后分成相等的两部分,用两种不同的方法冷冻:一种是炸熏法,将精液直接滴入液氮,在其中“炸”5—8秒后将颗粒捞出,继续在液氮面上方2cm处熏蒸6分钟;另一种是常规的氟板冷冻法.结果表明:炸熏法的效果优于氟板法,平均冻后活力分别为0.385±0.22和0.331±0.042(p<0.01);平均复苏率分别为53.57±3.55和45.75±1.91(p<0.05);平均顶体完整率分别为44.60±3.10和39.37±5.29(p<0.05).     

除去精浆、添加维生素E及水浴平衡对莎能奶山羊精液冷冻效果的影响

主要探讨精液离心、添加VE及平衡方法对山羊细管冻精冷冻-解冻后活力、顶体完整率等的影响,为提高山羊精液冷冻保存效果提供依据.试验1:将鲜精稀释后分为3组,第1组为稀释精液1 000 r/min离心6 min,去掉一半的上清液;第2组用相同的方法反复离心3次,完全去掉精浆;第3组不离心,做为对照.试验2:在稀释液中添加15 g/L VE,以不添加组作为对照.试验3:采用纱布包裹和水浴平衡两种方法.试验结果表明,离心去掉部分精浆组和离心去精浆组精子冷冻-解冻后的活力比不离心组高,差异显著(P＜0.05).精子顶体完整率和畸形率有所下降,但与对照组相比较差异不显著(P＞0.05).离心去掉部分精浆组和离心完全去精浆组相比,精子冷冻一解冻后的活力、顶体完整率和畸形率差异不显著(P＞0.05).冷冻稀释液中添加VE组的顶体完整率显著提高(P＜0.05),畸形率变化与对照组无差异(P＞0.05),精子活力提高效果也不明显(P＞0.05).精液冷冻前平衡方法以水浴法为好,与纱布包裹平衡组相比,水浴平衡组的活力和顶体完整率高(P＜0.05),精子畸形率较低(P＜0.05).可见,精液离心后去掉适量精浆可显著提高冷冻后精子的活力;添加VE可显著提高精液冷冻后精子的顶体完整率;与纱布包裹平衡法相比,水浴平衡法可显著提高精液冷冻后精子的品质.     

猪精液颗粒冷冻技术的研究

为提高猪冻精质量,加速猪冻精在生产上的应用,本试验以解冻后的精子活率、顶体完整率和体外受精(IVF)结果作为判定指标,探讨了冷源和Equex.STM对猪精液颗粒冷冻效果的影响。手握法采集成年、健康种公猪精液,分别采用含有Equex.STM的稀释液和普通稀释液进行两步法稀释,然后以干冰或液氮为冷源进行精液冷冻。结果表明,以干冰为冷源滴冻精液冻后活率为0.487833±0.046761,顶体完整率为0.782±0.039704,而以液氮为冷源的方法冻后活率为0.3334±0.055734、顶体完整率为0.5578±0.068482,前者在这两项指标上均显著优于后者(P<0.05)。另外,在稀释液中添加Equex.STM,以干冰为冷源进行滴冻,可使冻精顶体完整率极显著提高(P<0.01)。以含有Equex.STM的稀释液采用干冰滴冻的冻精进行IVF,胚胎卵裂率、囊胚率分别为0.5316±0.125582和0.216±0.053198。结果表明,采用Equex.STM作为冷冻保护剂并以干冰作为冷源可以获得高质量的猪冷冻精子。     

DMA和甘油对公鸡精子冷冻保护作用的比较

比较了6%的DMA和11%的甘油冷冻洪山公鸡精液后精子在存活率、顶体完整率方面的差异.结果表明,用DMA做冷冻保护剂的颗粒型冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体完整率分别为0.320±0.041和0.600±0.049,用甘油做冷冻保护剂的颗粒型冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体完整率分别为0.313±0.036和0.597±0.040,两者差异不显著.用DMA做冷冻保护剂的细管型冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体完整率分别为0.388±0.034和0.652±0.042,用甘油做冷冻保护剂的细管型冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体完整率分别为0.433±0.054和0.750±0.048,前者在精子存活率(P＜0.05)和顶体完整率(P＜0.01)方面都显著低于后者.     

猪精液冷冻保存的剂型及品种效应

为了评价细管类型在不同品种公猪精液冷冻中的效果,为猪精液冷冻的实际生产中冷冻细管的选择提供理论依据,试验将长白、大约克与杜洛克3种美系公猪(每品种7头次)精液进行不同细管类型(5.00、0.50、0.25 mL)的分装冷冻,比较各种细管类型下不同品种公猪之间和同一品种公猪不同细管类型精液冻后质量(冻后精子活力、畸形率及顶体完整率).结果表明,①相同剂型下,除了0.25 mL细管分装时杜洛克公猪冻后精子顶体完整率显著(P＜0.05)高于长白公猪外,3种公猪之间在3个指标上差异均不显著(P＞0.05);②3种公猪冻后精子活力最高的剂型均为0.50 mL细管,冻后精子畸形率及顶体完整率最好的剂型均为5.00 mL细管.总之,3种细管类型中,仅0.25 mL剂型存在品种效应,而3个品种公猪却存在着基本类似的剂型效应.     

公鸡精子冷冻保存后活率和顶体破损率的相关关系

用BPSE为稀释液,以终浓度为11%(V/V)的甘油作低温保护剂,冷冻洪山公鸡精液。测定了细管型和颗粒型2种类型的冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体破损率,并对冻后存活率和顶体破损率进行了相关和回归处理。测定结果表明,细管型冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体破损率分别为0.451±0.056和0.392±0.054(n=20)。颗粒型冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体破损率分别为0.339±0.040和0.543±0.052(n=20)。前者解冻后的活率极显著高于后者,而顶体破损率则极显著低于后者。相关分析结果表明,细管型冷冻精液解冻后精子存活率与顶体破损率之间的回归方程为y=0.7293-0.7126x,相关系数r为-0.697(P<0.01),而颗粒型冷冻精液解冻后的精子存活率与顶体破损率之间的相关系数为-0.0625(P>0.05),表明两者之间无显著相关。本研究为输入相等数量的活精子时细管型冷冻精液受精率显著高于颗粒型冷冻精液的试验结果提供了一定的理论解释,也为将保存家畜冷冻精液的方法应用于家禽方面作了有益的探索。     

猪精子冷冻技术的研究

 采用手握法采集健康成年的长白公猪猪精子，室温离心后，采用液氮熏蒸法细管冷冻猪精子。以精子活力为判定指标，比较了平衡时间和甘油浓度对猪精子冷冻的影响。结果表明:(1)Ⅱ组精子冷冻复苏后精子活力（35.83±5.38）%要高于其他组（P＜0.05）；(2)Ⅰ组和Ⅱ组冷冻复苏精子的活力［（29.75±4.38）%，（28.40±8.55）%］要高于其他组（P＜0.05），由此得出最佳平衡时间和甘油浓度。     

庆阳驴细管冻精的研制试验

为了研究甘肃庆阳驴的细管精液冷冻保存的效果.设计3种配方,选择最佳配方,将熏蒸距离按2、2.5、3cm分为三个组合,每个组合用6.5、7、7.5min三种时间进行液氮熏蒸处理,对庆阳驴冻精进行对比试验.结果显示,2#配方冷冻的庆阳驴精子活率、顶体完整率和质膜完整性分别为33.08＆#177;1.83、42.67＆#177;5.39和43.42＆#177;3.23,与1#和3#相比较好,组间差异显著（P＜0.05）.试验表明,最佳熏蒸距离为2.5cm和熏蒸时间为7min,庆阳驴细管冻精解冻后精子活率为33.08＆#177;1.83,与其他各组相比差异显著（P＜0.05）.结论：通过调整庆阳驴精液稀释液成分、pH值、渗透压,利用简易的液氮熏蒸方法可以完成甘肃庆阳驴精液冷冻保存.     

猪精液0.5 ml细管快速冷冻和解冻方法的优化

 【目的】优化冷冻-解冻方法,提高0.5 ml细管快速冷冻保存猪精液的质量。【方法】冷冻方法：分别将细管水平置于液氮面上方3、5、7、9和11 cm处,每一水平位置细管分别熏蒸3、5、10、15和20 min后投入液氮保存,37℃×30 s水浴解冻,确定最优冷冻方法;在选择最优冷冻方法的基础上,分别采用37℃×30s(对照组)、42℃×25 s、47℃×20 s、52℃×15 s、57℃×10 s和62℃×5 s共6种方法水浴解冻,确定最佳解冻方法。【结果】采用3 cm×10 min冷冻方法,解冻0、8 h精液中精子活率、质膜完整率和顶体完整率均最高。采用相对“高温短时”解冻,精子活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体膜电位均较高,同时丙二醛浓度降低;57℃×10 s和62℃×5 s解冻的精子各项指标无显著差异（P＞0.05）,但前4项指标显著高于对照组（P＜0.05）,丙二醛浓度显著降低（P＜0.05）。【结论】优化猪精液0.5 ml细管快速冷冻的冷冻和解冻方法可以显著提高解冻质量,采用3 cm×10 min冷冻、57℃×10 s或62℃×5 s解冻方法效果最佳。     

甘油浓度和平衡时间对藏獒精液冷冻效果的影响

以藏獒精液为研究对象,观察甘油浓度和平衡时间对对藏獒精液冷冻-解冻后品质的影响.试验表明,甘油浓度为2%和3%时,冷冻-解冻后精子在活力、精子畸形率和顶体完整率方面都显著优于甘油浓度1%和4%(P＜0.05),但2%和3%浓度之间无显著差异(P＞0.05);精子于甘油中经不同时间平衡后,冷冻-解冻后精子活力和顶体完整率以15 min和30 min显著优于其他平衡时间(P＜0.05),但2者之间无显著差异(P＞0.05).精液在甘油浓度为3%、甘油平衡时间为15 min时冷冻效果较好.     

不同冷源对民猪精液冷冻保存效果的影响

用干冰和液氮作为冻源对民猪精液冷冻效果进行研究,包括对精子活率及顶体完整率的影响.结果表明,以干冰为冻源进行民猪精液冷冻,解冻后精子活率为43.5％,顶体完整率为52.2％;以液氮为冻源进行民猪精液冷冻,解冻后精子活率为41.8％,顶体完整率为51.5％,二者差异不显著.     

不同浓度咖啡因对犬精液冷冻效果的影响

为提高犬冷冻精液的冷冻效果,试验向Tris-卵黄基础稀释液中添加不同浓度的咖啡因;结果表明:当所添加的咖啡因浓度为5.0mmoL/L时,精子活率为0.33±0.04(P0.01),显著对照组。添加浓度为12.5mmoL/L时,精子活率仅为0.23±0.04(P0.01),显著对照组。浓度为5.0mmoL/L时精子畸形率最低,为0.174±0.036(P0.01),显著对照组。但添加咖啡因的各组跟对照组在顶体完整率上并无显著差异。     

波尔山羊个体精子抗冻性研究

为了加速贵州省地方山羊品种改良,2000年9月试验采用常规的精液冷冻解冻方法,通过鲜精活力、畸形率、冻精活力、解冻后4 h存活指数、顶体完整率、谷草转氨酶(GOT)释放量等指标研究了3只波尔山羊精子的抗冻性,结果3只试验公羊精子抗冻性存在明显差异,968号公羊生存指数显著高于2022和098号(P<0.05),098号公羊谷草转氨酶释放量显著低于2022和968号(P<0.05),但其鲜精品质全部达到常规制作冻精的要求,配种试验,65.77 %(146/222)的受胎率也验证了3只公羊适宜制作冻精。     

添加V_(B_(12))、V_E、V_C对无角道塞特绵羊精液冷冻效果的影响

探讨在无角道塞特绵羊冷冻精液稀释液中添加VB12、VE、VC对精子冷冻品质的影响。在无角道塞特绵羊冷冻精液稀释液中添加不同质量浓度的VB12、VE、VC制作细管冻精,解冻后观察精子的成活率和顶体完整率等指标。结果显示,VB12添加0.003 g/L时能够显著提高解冻后的精子活率(P0.05)和精子顶体完整率(P0.05);VE添加2.5 g/L时,能够极显著提高解冻后的精子活率(P0.01)和顶体完整率(P0.01);VC的添加4.4 g/L时能够显著提高解冻后的精子活率(P0.05),但对冷冻后精子的顶体完整率无影响。在稀释液中添加VB12、VE和VC能使解冻后精子品质得到提高。VE添加后能够极显著提高冷冻精子的顶体完整率,应该优先考虑添加。     

季节变化对夏洛来种公牛精液品质的影响

从洛阳市白马寺种公牛站挑选年龄、健康状况相近且性欲旺盛的夏洛来种公牛5头,对其生产性能指标按春(3—5月)、夏(6—8月)、秋(9—11月)、冬(12—2月)4个季节连续五年的记录进行统计分析。结果表明:(1)采精量随季节变化不明显(P>0.05)。(2)原精活力:夏季(0.46±0.04)与春(0.70±0.01)、秋(0.65±1.01)、冬季(0.69±0.01)差异极显著(P<0.01)。(3)冻后活力:春、秋、冬季均极显著高于夏季(P<0.01),说明季节对夏洛来种公牛精液冻后活力具有明显影响。(4)精液密度:夏季与春、冬季差异极显著(P<0.01),夏季与秋季差异显著(P<0.05)。(5)精液冻后畸形率:夏季的夏洛来种公牛精子冻后畸形率极显著地高于其它季节(P<0.01)。(6)精液冻后的顶体完整率:夏季的夏洛来种公牛冻精顶体完整率极显著地低于冬、春季节(P<0.01),显著地低于秋季(P<0.05)。     

HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性的关系

【目的】探索热应激蛋白90（HSP90）表达量与牛精液冷冻-解冻后品质的关系。【方法】采用假阴道法采集身体健康、年龄2～4岁的9头荷斯坦奶牛精液（编号1～9）,测定新鲜精液指标（活力、形态、活率和密度）,评定其品质,合格的精液样品经过冷冻解冻后检测其精子活率、质膜完整率和顶体完整率,并根据冻后品质将其分为HFTs(High freezing resistance teams)和LFTs（Low freezing resistance teams) 2组,对精子HSP90蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和Western blot检测,分析其表达量与精子抗冻性的关系。【结果】不同牛个体精液冻后品质相差较大。SDS-PAGE电泳结果显示,HFTs组的分子质量约为90 ku的蛋白表达量显著高于LFTs组（P＜0.05）,经Western blot分析,该蛋白为HSP90。HSP90蛋白表达量与冷冻-解冻后的牛精子品质呈明显正相关,其与精子活率、顶体完整率、质膜完整率的相关系数分别为0.364,0.447和0.402。【结论】HSP90蛋白表达量可以作为判断牛精子抗冻性的指标之一。     

绵羊冷冻精液平衡方法研究

不同体积水浴平衡法和8层纱布包被平衡法对绵羊冷冻精液品质影响比较研究的结果表明:250 mL和200 mL 38 ℃ 体积水浴平衡的冷冻精子的活率、生存指数、顶体完整率分别为0.43和0.45、3.57和3.55,47.60 %和47.98 %,显著高于150 mL、100 mL、50 mL 38 ℃体积水浴和8层纱布包被平衡冷冻精子的活率、生存指数、顶体完整率(P<0.05);250 mL和200 mL38 ℃ 体积水浴平衡的冷冻精子GOT释放量分别为303.33和303.86(UL-1)(P<0.05)。200 mL38 ℃ 体积水浴平衡到达4℃的时间比250 mL38 ℃ 水浴平衡缩短0.5 h,因此,推荐生产实践中应用200 mL 38 ℃ 体积水浴2.5 h降温到4℃的平衡方法。     

人体精子冷冻前后超微结构的变化

将１０例正常生育男性的精液标本进行冷冻保存、复温后电镜观察。结果,冷冻精子复温后精子超微结构发生了不同程度的改变,其主要改变为精子顶体肿胀,顶体内、外膜分离,外膜形成波浪状皱褶,有的核局部出现凹陷,线粒体改变呈基质密度降低,结构模糊等。但是,精子基本结构保持完整。研究结果表明：冷冻精子超微结构改变的主要原因是在冷冻过程中,由于冰晶形成的影响,水分内移,细胞肿胀,因而造成其活动率的明显下降。但并不影响授精能力。     

不同解冻方法对奶牛细管冻精活力的影响

研究探讨了不同解冻方法对0.25 mL奶牛细管冻精解冻后的影响,细管冻精分别在5,15,40,75,90℃下不同时间（1～120 s）进行解冻操作,通过评定精子冻后活率、顶体完整率、尾膜完整率,筛选出最佳的奶牛细管冻精的解冻方法。结果表明：（1）奶牛细管冻精采用75℃解冻3 s,精子的活率最高,解冻效果最好;其次在接近体温40℃解冻20 s,效果也较好;在低温5℃和室温15℃解冻,精子活率低于0.3;在90℃高温解冻条件下不稳定,不适合生产使用;（2）90℃解冻精子的顶体完整率、尾膜完整率明显低于40℃和75℃,差异显著（P＜0.05）,但是精子畸形率却高于40℃与75℃的处理组（P＜0.05）,而后两者间差异不显著（P＞0.05）;（3）不同解冻温度解冻后精子在37℃时保持有效存活时间存在较大差异,表现为：40℃＞75℃＞90℃。因此,在生产实践中对奶牛细管冻精进行解冻时,可根据具体情况选用适合的解冻方法。若解冻后立即输精的,建议采用75℃下3 s解冻;解冻后不能立即输精的,为了使精子在较长时间内保持活力,宜采用40℃下20 s解冻。