马链球菌马亚种8组分融合蛋白的表达及小鼠免疫效果的评价

马腺疫是由马链球菌马亚种(S. equi)引起的急性接触性马属动物传染病，严重影响幼驹的生长发育。我国尚无预防该病的有效疫苗，也缺乏S. equi动物感染和免疫保护模型。为在原核系统中表达马链球菌马亚种(S. equi)的多组分融合蛋白，并评价其对小鼠的免疫保护效果，本研究以S. equi HLJ2018株DNA为模板，分别经PCR扩增其cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因，并分别克隆至pGEX-6p-1载体中，构建表达这8个蛋白的重组质粒并分别经PCR和测序鉴定。通过在各基因之间引入蛋白接头Gly-Gly-Gly编码基因序列并利用同源重组技术依次串联该8个基因，得到融合基因se8，利用其构建重组质粒pET-28a-SE8 (His标签)及pGEX-6p-1-SE8(GST标签)，均经PCR和测序鉴定后，将这两个表达SE8及分别表达该8个蛋白的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后采用亲和柱层析法纯化，采用SDS-PAGE检测各蛋白的表达及纯化效果；采用western blot检测各蛋白的反应原性。SDS-PAGE结果显示...     

马链球菌兽疫亚种ATCC35246酮基转移酶的原核表达及其免疫保护试验

根据已发表的马链球菌兽疫亚种MGCS10565酮基转移酶(transketolase)的基因序列,设计并合成引物。以ATCC35246株基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出目的基因并定向克隆至表达载体pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,分析并纯化表达产物。选用ICR小鼠作为实验动物模型,以纯化的重组融合蛋白通过皮下注射途径免疫小鼠,并用间接ELISA法监测小鼠血清中的抗体效价。结果表明重组蛋白免疫小鼠后能产生有效的免疫应答,血清中抗体水平有明显的升高。加强免疫2周后,以5LD50的ATCC35246强毒株攻击免疫组及对照组,结果免疫组小鼠的保护率可达37.5%。表明原核表达产物免疫ICR小鼠,可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用,在亚单位疫苗研制中具有潜在的应用价值。     

马腺疫链球菌 FNE 基因的克隆及原核表达

采用 PCR 方法从马腺疫链球菌新疆分离株中扩增 FNE 基因片段,克隆至 pMD19-T 载体。利用分子生物学软件分析测序结果,将 FNE 截短基因亚克隆至原核表达载体 pET-30a 中,转化到大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3）感受态细胞,以 IPTG 诱导 FNE 重组蛋白的表达,用 SDS-PAGE 和 Western blot 法分析蛋白表达及其反应原性。序列分析显示,其与 GenBank 收录的马腺疫链球菌4047（登录号YP002747216）核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99％。采用 PCR 法扩增到675 bp 的 FNE 截短基因片段构建重组表达载体获得重组蛋白,经 SDS-PAGE 分析在46 ku 处出现明显条带,Western blot 分析显示具有反应原性。成功克隆和表达了马腺疫链球菌的 FNE 截短基因,为重组 FNE 蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

马源马链球菌兽疫亚种新疆株的分离鉴定及遗传特性分析

为了解马源马链球菌兽疫亚种（S.zooepidemicus）新疆分离株马链球菌兽疫亚种类M蛋白（SzM）基因的分子进化与变异情况,为该菌引起的感染性疾病的防控提供依据,本试验对新疆地区某马场采集的病马淋巴结样品进行病原菌的分离培养和生化鉴定,并对分离菌株进行药物敏感性试验。根据已发表的马源SzM基因序列设计引物,对其SzM基因进行PCR扩增及序列测定。将获得的SzM序列与GenBank中不同动物源马链球菌兽疫亚种分离株序列进行同源性比对和遗传进化分析。结果显示,分离得到了一株革兰氏阳性链球菌,将其命名为马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对青霉素、磺胺嘧啶钠耐药,对其他14种药物均敏感。序列分析结果显示,马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与国内外不同动物源分离株SzM基因氨基酸同源性为56.0%~70.0%。遗传进化分析结果显示,这些菌株可分为4个群。马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与猪源分离株SzM蛋白的氨基酸同源性为59.9%,分别属于2个不同的群,其与美国马源分离株NH55426亲缘关系最近。本试验结果可丰富国内马源马链球菌兽疫亚种SzM基因的信息数据,为马链球菌兽疫亚种的致病机制研究和预防控制提供参考依据。     

迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ原核表达及免疫原性

为研究迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌flgJ基因,构建重组载体pET-32a-flgJ,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白大小约54 000;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌分离株ET-13进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为70%。本研究克隆了迟缓爱德华菌外膜蛋白flgJ基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组FlgJ蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

马链球菌马亚种的分离鉴定及fneB基因序列分析

新疆伊犁某地区一些马群中不断出现以全身多发性脓肿为特征的患病马匹,为了查明其是否为马腺疫,以及由何种马链球菌感染所致,无菌采集典型患病马匹脓汁样品,常规THB增菌,绵羊鲜血平板划线分离单菌落后,用透射电镜对分离菌的微观形态进行观察,PCR对其fneB基因进行克隆与序列分析,最后用生化试验进行验证。结果表明,从12匹患病马的脓肿组织中,共采集了25份样品,从中分离鉴定出来源于不同患病马的2株马链球菌马亚种菌株,这2株菌的形态均符合链球菌的特点;基因克隆测序结果表明,其中1株与英国源的兽疫亚种H70和马亚种4047核苷酸同源性较高,均达97%~98%,另1株与英国源的马亚种4047和瑞典源某马亚种核苷酸同源性较高,均达98%~99%。这2株菌之间核苷酸序列同源性达98.3%,氨基酸同源性则达99.3%。马链球菌马亚种是引起伊犁某地区这些患马全身多发性脓肿的主要致病菌,它们可能来源于之前从欧洲和美洲引进的马匹,提示在进行疫病防控工作时,要特别注意海关检疫,积极防止疫病的传入。     

马源马链球菌兽疫亚种新疆株的分离鉴定及遗传特性分析

为了解马源马链球菌兽疫亚种(S.zooepidemicus)新疆分离株马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzM)基因的分子进化与变异情况,为该菌引起的感染性疾病的防控提供依据,本试验对新疆地区某马场采集的病马淋巴结样品进行病原菌的分离培养和生化鉴定,并对分离菌株进行药物敏感性试验。根据已发表的马源SzM基因序列设计引物,对其SzM基因进行PCR扩增及序列测定。将获得的SzM序列与GenBank中不同动物源马链球菌兽疫亚种分离株序列进行同源性比对和遗传进化分析。结果显示,分离得到了一株革兰氏阳性链球菌,将其命名为马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对青霉素、磺胺嘧啶钠耐药,对其他14种药物均敏感。序列分析结果显示,马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与国内外不同动物源分离株SzM基因氨基酸同源性为56.0%～70.0%。遗传进化分析结果显示,这些菌株可分为4个群。马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与猪源分离株SzM蛋白的氨基酸同源性为59.9%,分别属于2个不同的群,其与美国马源分离株NH55426亲缘关系最近。本试验结果可丰富国内马源马链球菌兽疫亚种SzM基因的信息数据,为马链球菌兽疫亚种的致病机制研究和预防控制提供参考依据。     

犬链球菌保护性抗原的鉴定

为克隆、表达犬链球菌(S.canis)保护性抗原基因,并对其表达产物进行免疫原性分析.本研究以Lambda ZAP Ⅱ载体构建了S.canis的3 kb～8 kb随机基因组文库,通过S.canis阳性血清筛选和质粒拯救,获得一株阳性克隆重组质粒并进行了序列测定.通过BLAST分析并与GenBank中登录的相近基因序列比较发现,该基因为S.canis的1个保护性抗原(SPASc)基因,该基因与兽疫链球菌和产脓链球菌的保护性抗原及马链球菌M蛋白基因具有一定的同源性.根据该序列设计特异性引物,经PCR扩增、克隆并进行了SPASc基因的原核表达.用纯化SPASc重组蛋白免疫兔制备的血清对小鼠具有保护性作用.     

马流产沙门菌鞭毛蛋白FljB的表达及对小鼠免疫效果的分析

为评价马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FljB(flagellin B)的免疫原性及免疫效果,本试验通过PCR扩增该菌的鞭毛蛋白基因FljB,构建重组质粒pET28a-FljB,并用表达纯化的重组蛋白FljB免疫小鼠。结果显示,该重组蛋白大小约为41 300。该蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平,二免后小鼠血清中抗体水平可达1∶21 500。该蛋白免疫后对小鼠的攻毒保护力为75%。本试验结果为进一步利用该蛋白进行马相关传染病的预防与控制奠定基础。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著（P〈0.05）,而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

马链球菌兽疫亚种SeseC-00619蛋白的功能研究

为了阐明马链球菌兽疫亚种新蛋白SeseC-00619(细胞表面蛋白,cell surface protein,CSP)的功能,本试验采用real-time qPCR分析CSP的体内诱导表达特征,同时在大肠埃希菌中表达与纯化马链球菌兽疫亚种表面相关蛋白CSP,研究其免疫反应性及免疫保护功能,并试图解释其分子机制。通过流式细胞术与黏附抑制试验探索CSP对小鼠肺上皮细胞的黏附作用。结果表明,CSP是一个重要的体内诱导抗原,并且能在S.zooepidemicus细菌表面表达,属于细菌表面蛋白。重组蛋白CSP能够黏附LA-4细胞表面,而这种黏附作用可以竞争性抑制S.zooepidemicus黏附宿主细胞。本结果为进一步研究CSP基因的功能及其在致病机制中的作用奠定了基础。     

驴源马腺疫链球菌的分离与鉴定

目前,关于马腺疫链球菌感染驴的报道较少。本研究从山东省某驴场的2只病驴颌下淋巴结肿胀化脓液中分离出2株病原菌,经染色镜检、生化试验和16S rDNA的PCR测序鉴定,确定该病原菌为马链球菌马亚种。采用纸片扩散K-B法,对分离菌进行药敏试验,发现其对恩诺沙星、氯霉素、环丙沙星、头孢噻肟和美罗培南高度敏感。本研究为驴感染马链球菌马亚种的诊断与防治提供了参考。     

马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因克隆、表达及其多克隆抗体的制备

为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a（+）中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15 ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1：128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

马链球菌兽疫亚种PepO蛋白原核表达及其免疫保护试验

以马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus,SEZ)ATCC35246株基因组为模板,根据NCBI数据库已公布的pepO基因序列设计引物进行扩增,利用同源重组技术连接至pCold-SUMO质粒进行原核表达及纯化,并以纯化的蛋白制备兔抗SEZ PepO多克隆抗体.将兔...     

迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

马链球菌马亚种3种抗原蛋白对小鼠免疫的免疫原性分析

旨在对比研究马链球菌马亚种（Streptococcus equi subsp.equi,S.equi）3种不同抗原蛋白——分选酶A （sortase A,SrtA）、M蛋白（SeM）及IgG结合蛋白（EAG）的免疫原性及免疫保护效果,本研究以表达并纯化的SrtA、SeM及EAG 3种蛋白单独及联合免疫小鼠,免疫后检测了血清抗体效价、抗体亚型、攻毒保护率,以real-time PCR定量检测免疫相关分子,并对攻毒后的肝、脾、肺、肾荷菌量进行检测和病理组织学观察。结果显示：联合免疫组诱导产生的抗体效价及IgG、IgG1和IgG2b的抗体水平均高于各种蛋白单独免疫组,SrtA诱导的IgG2a抗体水平高于SeM和EAG免疫组;攻毒保护力、荷菌量及病理组织学观察结果表明,联合免疫组优于SeM和EAG免疫组;免疫相关分子的荧光定量PCR检测结果显示,SrtA诱导的MHCⅠ、TCR、TLR2、TLR3及TLR4的转录水平显著高于SeM、EAG免疫组和对照组,3种抗原联合免疫可显著提高MHCⅠ分子及TLR3分子的转录水平。综上表明,SrtA具有较强的免疫调节和诱导能力,3种蛋白联合免疫可诱导产生较高的免疫水平和良好的免疫保护效果。该结果为马腺疫亚单位疫苗的研究提供了理论参考和试验基础。     

中国株马传染性贫血病病毒S2基因的原核表达及其多克隆抗体制备

本实验为表达马传染性贫血病病毒(EIAV)S2蛋白和制备其抗血清,以EIAV感染性分子克隆pFDDV3-8为模板扩增S2基因,将其克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,将S2基因亚克隆于pET-30a表达载体,构建S2基因的重组表达质粒(pET-EIAV-S2),并转化DH5α受体菌.以终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导,表达的重组蛋白约20 ku.Western blot分析表明,该蛋白可与EIAV的阳性血清反应,具有免疫原性.该重组蛋白通过镍离子亲和层析进行纯化后,免疫新西兰兔.ELISA及western blot分析表明,制备的兔多克隆抗体与EIAV的S2蛋白发生特异性反应.EIAV S2蛋白的重组表达及其抗体的制备为进一步研究S2辅助蛋白在EIAV复制与致病中的作用,以及S2基因反向遗传研究奠定了基础.     

马链球菌兽疫亚种的保护性抗原SzP蛋白的鉴定与评价

马链球菌兽疫亚种是引起猪链球菌病的主要病原之一。该菌的致病机理尚不清楚,且缺乏合适的疫苗,使猪链球菌病很难得到有效的控制。本实验通过构建SzP重组表达载体,纯化重组蛋白,对其的免疫效力进行了评价。结果表明该蛋白可以诱导高滴度的血清IgG抗体,并且可提供一定的免疫保护效力。进一步研究表明该蛋白是一个重要的体内诱导抗原,可诱导高水平的Thl和Th2型免疫应答。揭示了SzP蛋白在致病过程中起到重要作用,为新型疫苗的研制及致病机制的研究奠定了基础。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。