Ac/Ds转座子系统及其在玉米突变体库构建中的应用

Ac/Ds转座子系统是研究玉米功能基因组学的重要工具。Ac/Ds转座子系统以其在基因组中的低拷贝、倾向插入基因外显子、可以在同一基因不同位点造成突变等独特优势,在构建玉米突变体库和进行基因功能鉴定方面具有重要应用前景。综述了Ac/Ds转座子系统的插入特点、转座机制、在玉米突变体库构建中的应用以及我国玉米突变体库的现状,并对我国玉米Ac/Ds突变体库的研究提出展望。     

玉米AGPase小亚基基因的扩张分析

采用生物信息学方法分析AGPase家族基因的系统发育关系和基因结构特征，基于玉米B73参考基因组(AGPv4)新鉴定玉米AGPase小亚基编码基因，同时根据序列比对结果重新注释基因组中发生扩张的AGPS片段基因。结果表明，新鉴定并重新注释的ZmAGPS2-3、ZmAGPS2-4、ZmAGPS2-5基因包含1个序列高度相似的外显子，由祖先基因ZmAGPS2-2的多个外显子(无内含子)序列拼接形成。其编码蛋白的保守结构域存在不同程度的缺失，且这3个基因在染色体上的位置无共线性关系，也不相邻。因此推测，ZmAGPS2-3、ZmAGPS2-4和ZmAGPS2-5基因起源方式为反转录转座复制，在演化过程中丢失了部分序列后成为功能缺失的假基因。     

玉米Mutator转座子

Mutator转座子因其拷贝数高、正向突变频率高、倾向于插入低拷贝的DNA序列等独特的遗传特性，已成为基因组学研究中重要的诱变剂之一。本文对Mutator转座子的发现、Mutator家族的分类、Mutator转座子的特性、Mutator元件的表观调控、Mutator转座子标签在植物基因组学研究中的应用作了综述。对Mutator系统的研究进行了展望。     

大麦基因组中Helitron转座元件的计算预测

Helitron是一类新发现的DNA转座元件,具有捕获宿主基因片段的能力,因而对植物基因及基因组的进化具有重要意义。为了研究麦类作物中这类元件对基因组的进化所起的作用,本研究采用一种改进的局部组合变量(LCV)方法对大麦基因组中的Helitron转座元件进行了预测,共鉴定了16 560个潜在的Helitron元件,去除假阳性后这些元件约占基因组的2.2%。基于序列分歧的计算发现,绝大多数Helitron形成于最近的900万年内,并且在大约250和550万年前各经历了一次剧烈扩张。在大麦基因组中发现了3个自主型Helitron元件,它们包含Rep和Helicase结构域的编码区。基因片段捕获分析发现,66.5%的元件平均捕获了1.9个基因片段,除了反转座和转座相关的基因外,参与发育调控的NAM家族转录因子和参与水分运输和环境胁迫响应的软木脂素合成酶基因也被高频捕获,表明Helitron转座元件不仅影响大麦基因组的结构,同时可以驱动特定功能基因的扩增。     

转Bt基因抗虫玉米发展状况及对非靶标昆虫的影响

转Bt基因抗虫玉米是目前商品化进程最快的转基因作物之一,并被广泛应用于农业生产,其抗虫性和经济效益已得到普遍肯定,但外源基因的导入一定程度上改变了玉米自身的基因序列,因此转Bt基因抗虫玉米对生态安全的影响也备受关注。本文从转Bt基因抗虫玉米发展现状及对非靶标昆虫影响的角度对转Bt基因玉米的安全性研究加以综述。     

玉米ZmNRT关键基因挖掘以及氮响应基因共表达网络构建

以玉米自交系B73（V4版本）作为参考基因组,利用生物信息学方法鉴定玉米ZmNRT基因家族成员,从系统发育关系、GO（Gene Ontology）富集、基因结构和玉米不同时期及组织下的表达谱等方面全面解析玉米ZmNRT基因家族。基于qPCR实验和共表达网络分析,对玉米ZmNRT家族基因在氮响应中的作用进行系统的研究。结果表明,在玉米全基因组水平上共鉴定到 162 个 ZmNRT 基因,主要分为 ZmNRT1（62 个）和 ZmNRT2（100 个） 两大类群。GO富集发现,仅46个基因参与硝态氮转运过程,这些基因被不均等分成7个亚家族,每个家族1～15个基因。基因表达模式分析结果显示,不同生育期和组织下ZmNRT基因表达是差异的。在氮诱导下,qPCR鉴定结果显示,12个ZmNRT基因是氮响应基因,9个基因表达上调,3个基因表达下调。共表达网络结果发现,其中10个ZmNRT基因与已知的氮代谢基因存在显著共表达关系（|r|>0.8 p-value<0.05）,推测这10个基因可能是调控玉米氮代谢的关键基因。     

转Bt基因玉米的抗螟性及产量分析

在玉米心叶期和穗期对3个转Bt基因玉米品种及其相对应的受体品种进行人工接虫,分析了转Bt基因玉米对玉米螟的抗性及对产量损失的影响。结果表明：转Bt基因玉米在玉米心叶期,对一代玉米螟表现为高抗;在穗期,对二代玉米螟也表现高抗。在接虫条件下,转Bt基因玉米可以减少产量损失30%以上。因此,种植转Bt基因玉米具有明显增产作用和经济效益。     

玉米配子体基因研究进展

玉米的杂交不亲和性是受单基因控制的,为配子体控制型,该基因位于玉米的第四染色体上.配子体基因可导致与其连锁的基因发生偏分离现象.大多数爆裂玉米为Galgal基因型,而北美马齿玉米和硬粒玉米为galgal基因型.在玉米属中存在两个杂交不亲和基因系统:Gal和Gat系统.Gal和Gat是独立起作用的,它们之间是相互不亲和的,但并非绝对的不亲和,而是表现出较弱的不亲和性.Gal表现为部分显性,而Gat具有中等强度的杂交不亲和性.在玉米属中,既存在完全的杂交不亲和性,也存在程度不同的部分不亲和性.自然群体中,Ga基因具有生殖隔离作用.带有Ga基因的玉米,可使其它材料授粉结实,而其它玉米的花粉却不能使它正常结实,除非带有相同的显性基因;这种杂交不亲和性具有遗传隔离和防杂保纯的作用,可避免外来花粉的污染,保证种子纯度和发挥杂种优势。     

缺氮胁迫下玉米组蛋白乙酰化相关酶的动态表达特征

研究缺氮对玉米自交系B73组蛋白修饰酶的影响，分析组蛋白修饰如何对玉米发育过程中土壤氮浓度的波动进行微调适应不同的氮浓度环境提供一定的理论依据。结果表明，吐丝后1～2周，缺氮雌穗的穗长和干重分别降低16.2%～19.7%和35.6%～44.4%，氮浓度在吐丝后第二周降低13.3%。利用qRT-PCR技术，对玉米苗期以及雌穗形成关键时期的组蛋白乙酰化酶（GCN5和HAT-B）和去乙酰化酶基因（HD1b，HD2，HDA101，HDA102，HDA106和HDA108）的表达进行分析，苗期缺氮8 d，除HAT-B基因外，其余7个基因的表达水平均急剧上升；缺氮36 h，HAT-B、HDA101、HD1b和HD2基因的表达量增加；缺氮处理2 d，基因HDA106和HDA108的表达水平下调。吐丝期雌穗，除HAT-B、HD1b和HD2基因外，其余5个基因都有较高的表达水平；在吐丝期前1周，缺氮导致HDA101和HDA106基因的表达水平均显著上调；基因HD1b和HD2在吐丝期后第二周表达水平则明显下调。缺氮胁迫使ZmHATs和ZmHDACs的表达可能存在协同性、功能分化性、时空摆动性以及通过不同途径调控植物对缺氮胁迫的响应等特征，说明ZmHATs和ZmHDACs在玉米缺氮胁迫适应中发挥着重要作用。     

酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化

以黑曲霉基因组DNA为模板, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序。DNA序列分析表明：克隆片段长为1 340 bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%。将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子。     

玉米Mutator转座子的结构特征与作用性质

玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统3大类,其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10-4~10-5,比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法对相关的突变基因进行克隆。本文主要对Mutator转座子的种类、结构特征和作用性质进行综述,并对Mutator转座子的研究应用进行展望。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

玉米耐冷基因ZmCOLD1的结构和表达模式分析

低温冷害是影响玉米生产的重要环境因素之一。基于水稻中调控耐低温的OsCOLD1基因编码序列,通过Blast比对获得高度同源的玉米ZmCOLD1基因编码序列,进而对ZmCOLD1基因的分子特征和编码蛋白的亚细胞定位进行分析,并进行ZmCOLD1基因过表达遗传转化载体的构建。结果表明,ZmCOLD1基因编码区长度为1 647 bp,编码548个氨基酸,理论等电点(pI)4.95,估计分子量为137 457.13 Da,属疏水蛋白。利用ClustalX进行蛋白质序列的比对,进行ZmCOLD1基因系统进化树分析,ZmCOLD1氨基酸序列与水稻的亲缘关系较近。通过构建目的蛋白与GFP融合的表达载体pCAMBIA1302-GFP-ZmCOLD1并注射烟草,发现ZmCOLD1蛋白主要集中在细胞质膜中。     

河南省玉米穗粒腐病病原串珠镰刀菌鉴定

河南省玉米穗粒腐病一般发病率为10%～30%,串珠镰刀菌是优势病原菌。从河南郑州感病的玉米穗轴和穗粒上分别分离出两个镰刀菌菌株。运用培养性状和形态特征综合分析的方法进行种类鉴定,并提取基因组DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。结果鉴定出1个种为串珠镰刀菌。两个菌株rDNA间区ITS2可变区属I型,均能产伏马菌素。     

玉米Rp3基因LRR结构域的多态性及进化分析

玉米扩锈病基因Rp3是来源于玉米B73自交系中的一类NBS-LRR抗病基因。研究中提取了87个玉米自交系基因组,在52个自交系中扩增到Rp3基因的LRR结构域片段。利用生物信息学对LRR结构域的核酸多态性、选择压力及不同杂种优势群中的遗传差异等参数进行分析。Rp3基因的LRR结构域在核酸水平上变异程度较高,核苷酸多态性π值为0.062 36,存在较多的多态性位点;Ka/Ks值的估算发现该基因的LRR结构域总体上受到纯化选择作用。Rp3基因的LRR结构域在5种杂种优势群中的遗传多态性存在明显差异。     

棉铃虫对转基因抗虫玉米的行为反应

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是Bt玉米的重要靶标害虫之一。规避行为可以减少害虫与Bt玉米的接触而降低生理抗性选择压力。通过比较棉铃虫对Bt玉米与常规玉米的行为反应评估棉铃虫对Bt玉米的行为规避能力,产卵选择结果显示,棉铃虫成虫在Bt玉米上的落卵量显著低于常规玉米;无选择条件下,仍然出现Bt玉米上的落卵量显著低于常规玉米的现象。幼虫实验结果显示,棉铃虫初孵幼虫在Bt玉米植株上的居留时间显著短于在常规玉米上的居留时间。研究结果证明,棉铃虫对Bt玉米具有一定的行为规避能力。     

玉米ZmCOL3pro217启动子的克隆及功能分析

ZmCOL3是玉米开花期光周期调控网络中一个重要的功能基因,研究发现自然群体中该基因的启动子存在遗传变异,推测这些变异可能参与玉米开花调控。研究从热带血缘玉米材料CIMBL119中克隆了ZmCOL3启动子,命名为ZmCOL3pro217。序列比对发现,该启动子序列与温带血缘玉米B73序列存在1个217 bp大片段置换。生物信息学分析表明,ZmCOL3pro217含有分生组织特异性、光响应、胁迫响应等多个顺势作用元件,预测ZmCOL3pro217可能具有组织特异性,并通过响应光和胁迫反应参与玉米开花调控。进一步构建ZmCOL3pro217驱动gus报告基因表达载体,转化玉米,实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附剂测定、GUS组织化学染色等研究结果发现,转基因植株中ZmCOL3pro217驱动gus基因在根和叶器官中高表达,而在茎、花丝和子粒中几乎不表达,证实ZmCOL3pro217是1个新的组织特异性表达启动子。     

耐盐碱转基因玉米的获得及其抗性分析

依据Gen Bank数据库中发表的拟南芥DREB基因序列进行优化,人工合成DREB基因序列,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法将DREB基因转入玉米自交系Hi II中,获得转DREB基因玉米材料,经过分子检测获得4个阳性转化事件。在不同浓度水平的Na Cl溶液(40、80、120 mmol/L)和Na_2CO_3溶液(10、20、30 mmol/L)胁迫下,研究其耐盐碱性。结果表明,DREB基因已经整合到玉米基因组中,转DREB基因玉米的耐盐碱性获得显著提高,80 mmol/L的Na Cl溶液和20 mmol/L Na_2CO_3溶液可以作为转DREB基因玉米的耐盐碱分析条件。     

玉米株型相关基因ZmDwarf2的克隆及表达分析

以玉米紧凑型自交系豫82、平展型自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆了与水稻Dwarf基因同源的玉米Dwarf2基因,该基因水稻上通过参与BR生物合成途径调控其株型形态建成。序列分析发现,玉米Dwarf2基因cDNA序列全长1 501bp,开放阅读框1 398bp,编码465个氨基酸。与水稻Dwarf基因的同源度达84%。实时荧光定量PCR分析表明,豫82、沈137中Dwarf2基因表达趋势基本一致,3～4叶期表达量低,8～12叶期处于表达高峰,13叶期后表达量逐渐下降。沈137中表达量较豫82高;就不同器官来说,沈137在叶片、叶枕、叶鞘、茎尖等器官中表达量较豫82高,其中,叶枕处ZmDwarf2表达量相对较高,而叶鞘上ZmDwarf2表达量相对较低。可以推测,基因ZmDwarf2可能参与玉米中BR生物合成途径,进而调控其相关株型形态建成。