草鱼PGC-1α基因的表达及饲喂n-3 HUFAs对其影响

获得了草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)部分cDNA序列(GenBank注册号为HM015283),并进行了序列同源性分析;采用实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法,检测了PGC-1α基因在草鱼不同组织的表达状况;研究了投喂高不饱和脂肪酸(HUFAs)对草鱼肝胰脏PGC-1α基因时序表达的影响。结果显示,所获得的草鱼PGC-1α基因部分cDNA序列长度为612bp,与人、牛、小鼠、斑马鱼和金鱼等动物的同源性为75%～97%;该基因在草鱼肝胰脏、肾脏、肌肉、心脏、鳃等10个组织中均有表达,其中在肾脏和心脏中表达丰度最高,在精巢和脾脏中表达丰度最低;草鱼摄食HUFAs饲料后第7天PGC-1α基因的表达水平极显著升高,随后又迅速下降。研究首次克隆得到草鱼PGC-1α基因部分cDNA序列,并发现该基因在草鱼能量代谢水平高的组织中表达较高,且其表达受到HUFAs的调控,其时序表达模式为先升高,然后恢复到正常水平。     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

草鱼APN基因的克隆及表达特征

氨肽酶N(APN)是肽酶M1家族的成员之一,在蛋白质的消化中发挥重要作用。采用同源克隆和RACE技术首次克隆草鱼APN基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为3258bp,包含27bp的5UTR序列,552bp的3UTR序列,2679bp开放阅读框,编码892个氨基酸;草鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为81.5%和75.4%,与其他动物同源性分别为58.8%～61.2%和54.3%～60.2%。经预测,其编码蛋白的分子量为100.61ku,等电点为5.14,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的1个螺旋跨膜结构,但跨膜区氨基酸同源性较低;系统进化分析表明,草鱼APN基因与斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-timePCR技术检测了该基因的发育表达,结果显示草鱼出膜4d后APNmRNA表达量相对稳定;APN在草鱼前肠、中肠和后肠均有较高的表达量,以前肠组织表达量最高;昼夜节律研究发现,肠道APN基因06:00-18:00的表达量较18:00-06:00高。     

草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2 cDNA基因克隆与表达研究

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,克隆y+LAT2基因cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR探讨y+LAT2在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)各组织中的表达情况以及饥饿对其mRNA的影响。结果表明,获得的y+LAT2基因的cDNA序列片段为1849bp,含1371bp的核心序列,编码456个氨基酸。预测草鱼氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性高达96.5%,与哺乳动物和两栖动物的同源性在78%～83%,构建的系统进化树与传统形态学分类一致。在草鱼的肌肉、脑、鳃、心、肾脏、肝、后肠、中肠、前肠、脾脏组织均检测到y+LAT2基因的表达。草鱼脾脏、肾脏以及前肠、中肠的y+LAT2 mRNA表达水平对禁食的反应不同,在短期饥饿(14d)期间,其y+LAT2 mRNA表达水平均呈下降趋势。草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2基因全长cDNA序列的获得,有利于进一步探讨鱼类氨基酸的吸收转运机制。     

草鱼Bcl-2基因的克隆、组织表达分析及DHA诱导下其在脂肪细胞中的表达变化

为获知草鱼B细胞淋巴瘤基因-2(B cell CLL/ lymphoma-2, Bcl-2)基因序列及其在草鱼各组织和脂肪细胞中的表达变化,本研究通过cDNA快速末端扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术获得了草鱼Bcl-2的全长cDNA序列,并采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测了Bcl-2在草鱼不同组织中的表达情况。为研究二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)对草鱼前体脂肪细胞凋亡的诱导作用,本研究检测了100 μmol/L DHA处理后,草鱼前体脂肪细胞中Bcl-2基因的时序表达。结果显示,所获得的草鱼 Bcl-2 基因全长cDNA序列长度为1292 bp,包含133 bp 的5′非翻译区(untranslated region, UTR)和784 bp 的3′UTR;开放阅读框为375 bp, 编码124 个氨基酸。草鱼Bcl-2与鲤、斑马鱼Bcl-2氨基酸同源性分别为89.5%和91.1%,与人、原鸡、小鼠、野猪、欧洲牛、褐家鼠、家猫和犬等其他动物的氨基酸同源性为57.7%-62.0%。其编码蛋白的分子量为14.14KDa,等电点为4.68。Bcl-2基因在草鱼心脏、肝胰脏、脾脏、鳃、肾脏、肌肉、腹腔脂肪组织、脑、小肠、精巢10个组织中均有表达,其中在腹腔脂肪组织、肾脏和精巢中表达丰度最高,在肌肉中表达最低。DHA处理草鱼前体脂肪细胞后,Bcl2基因表达在增殖阶段下调,而在分化阶段上调。研究表明,Bcl-2在草鱼各组织中广泛表达,且DHA对其在脂肪细胞中的表达具有调控作用。     

草鱼SREBP-1基因的克隆及糖对其在肝脏中表达的影响

固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控糖脂代谢相关基因表达的关键核转录因子。为获知草鱼SREBP-1基因的序列及其在肝脏中的表达规律,本实验采用同源克隆和RACE方法获得了草鱼SREBP-1基因的部分cDNA序列,并通过生物信息学方法对该基因及所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术,对SREBP-1基因在8种不同组织的表达规律及低糖(糖含量24%)和高糖(糖含量42%)投喂条件下肝脏中的表达水平进行了研究。结果显示,所克隆到的草鱼SREBP-1基因cDNA长4 760 bp,其中包括开放读码框3 426bp,编码1 141个氨基酸;草鱼SREBP-1具有一个典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构(bHLH-zip);氨基酸序列比对结果显示,草鱼SREBP-1与其他鱼类的同源性在76%~88%之间,与斑马鱼的进化关系最近;草鱼SREBP-1基因在脑中的表达量最高,肝脏和肠次之,在肾脏、脾脏、肌肉、脂肪和性腺中均有少量表达;与对照组相比,SREBP-1基因在高糖诱导下表达量显著提高(P0.05),低糖诱导下没有显著性差异。研究表明,在高糖负荷条件下,草鱼肝脏中SREBP-1可能会促进糖的利用和转化,从而参与糖代谢调节过程,为丰富鱼类糖代谢调控机理提供研究资料,并有望为提高鱼类对饲料糖的利用效率提供理论依据。     

jnk3基因在金鱼和斑马鱼不同发育时期胚胎与成体不同组织中的分化表达

JNKs是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员,参与应激反应和动物体轴的构建。为了进一步了解JNK家族在动物发育中的功能,首次分离和克隆了金鱼jnk3基因,研究了jnk3在金鱼和斑马鱼组织特异性和胚胎发育特异性表达状况。金鱼jnk3基因cDNA总长1 794 bp,其中阅读框1 293 bp,编码430个氨基酸。对jnk3基因序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析,结果显示,jnk3基因在脊椎动物较为保守,金鱼jnk3基因核苷酸序列与斑马鱼、人的同源性分别为94.1%和80.7%,金鱼jnk3基因氨基酸序列与斑马鱼、人的同源性分别为99.7%和93.4%。jnk3基因在鱼类成体中的表达存在着显著的组织差异,在金鱼和斑马鱼脑和精巢组织的表达具专一性,此外在斑马鱼心脏中也检测到jnk3的表达。RT-PCR检测结果显示,在鱼类胚胎发育中,神经胚期开始检测到jnk3基因mRNA表达,从神经胚到心跳期胚胎,jnk3基因表达水平逐渐增高,此后直至出膜一直保持较高的表达水平。研究表明,jnk3基因可能在鱼类后期的胚胎发育和成体脑、精巢与心脏发育中具有重要作用。     

草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基cDNA的克隆及表达特征

为了解草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NADPH多酶复合体的基因结构及其在机体的防御体系中的功能,利用RT-PCR结合RACE-PCR的方法,克隆草鱼NADPH氧化酶的2个调节亚基p40phox和p47phox的cDNA,对其编码的氨基酸序列进行了同源性比较和功能域分析,同时对这两个亚基在草鱼不同组织中的差异性表达进行分析。结果显示:p47phox亚基cDNA序列全长为1 589 bp,开放阅读框长度为1 233 bp,编码410个氨基酸;p40phox亚基cDNA序列全长为2 103 bp,开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸。这两个亚基编码的氨基酸序列与其他鱼类的同源性在68%~96%,具有其它鱼类类似的PX,SH3,PB1和PC功能域。组织差异性表达分析结果表明:2个调节亚基在草鱼胸腺、心脏、头肾、鳃、肠、肝、肾、脾和皮肤组织中均有表达,在不同组织中的表达强度略有差异,在心脏、胸腺中表达水平最高,在肝脏中表达水平较低,但是不同组织之间的表达水平差异不显著(P>0.05)。     

草鱼孕烷X受体与细胞色素P450 3A mRNA表达相关性初步研究

根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)基因序列设计保守区域简并引物,通过PCR扩增获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PXR cDNA核苷酸序列片段为509 bp,经推导获取169 aa序列。对草鱼与其它物种PXR氨基酸序列进行同源性比较,用以鉴定其在物种中的进化。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测草鱼9种组织PXR和细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)基因mRNA相对含量,结果表明,其表达丰度依次为:前肠﹥肝脏﹥肾脏﹥鳃﹥肌肉﹥后肠﹥性腺﹥心脏﹥脾脏,CYP3A和PXR基因在草鱼组织中表达分布基本一致,在前肠、肝脏和肾脏高度表达,而在其它组织低度表达。为了进一步研究PXR和CYP3A基因表达相关性,通过细胞,特选用诱导剂利福平(rifampicin,RIF),最佳诱导浓度40μM,孵育1、2、4、6、8、10、12、24 h后,用qRT-PCR检测CYP3A-PXR基因动态表达过程。结果显示,诱导组CYP3A和PXR基因表达量均高于对照组,显示出显著诱导效应。     

虹鳟不同养殖群体杂交F_1及其自繁系生产性能的比较

利用5个不同遗传背景的虹鳟养殖群体(以A、B、C、D、E分别表示虹鳟的渤海、丹麦、道氏、挪威、加州养殖群体)为材料,采用单因子和多因子两种交配策略,于2004年12月14日,建立了虹鳟不同亲本的杂交系和自繁系,由20个正、反交组合与5个自繁群组成,对其生产性能进行了近两年的比较试验。结果表明:从开食到1+龄鱼阶段(2005-03~2006-10),各杂交组合成活率的平均值与渤海、丹麦、道氏、挪威和加州自繁系相比分别提高了25.21%、2.34%、7.18%、4.18%和5.92%;各杂交组合饲料系数的平均值比渤海自繁系降低了19.74%,与其他养殖群体相比差异不显著(P>0.05);A♀×B♂、C♀×A♂和C♀×B♂组合的生长速度相对于五个自繁系分别提高了13.1%、9.2%和1.5%,且差异显著(P<0.05)。而从11月龄到22月龄(同环境饲育阶段),A♀×B♂、C♀×A♂、C♀×B♂和D♀×B♂组合相对于五个自繁系的平均生长速度分别提高了9.3%、17.5%、16.7%和8.9%,差异极显著(P<0.01)。五个群体间存在的遗传差异是它们能够获得杂种优势和性状得到改良的基础。     

口蹄疫新型疫苗的研究现状

口蹄疫是当今世界列为A类疫病的家畜传染病之一,危害牛、猪、羊等偶蹄动物,传播迅速,感染率高,一旦流行,往往造成严重的经济损失,对全世界畜牧业影响极大。目前大多数流行口蹄疫的国家采取以计划免疫为主的措施预防和控制口蹄疫。由于传统疫苗免疫期短,存在散毒、毒力"返祖"等可能,所以人们正在积极探索安全有效的新型疫苗的研究。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,口蹄疫新型疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现,本文就这一方面作一综述。     

重组毕赤酵母SMD1168/pGAPZaA-VAP1稳定性及发酵表达WSSV-VAP1

研究发酵时间和接种量对WSSV-VAP1重组菌蛋白表达量的影响及重组毕赤酵母中外源基因的稳定性.结果表明,构建的重组菌SMD1168/pGAPZaA-VAP1在发酵72h后,蛋白表达量占总蛋白10.45%,控制接种量对基因工程菌Pichia pastoris表达WSSV-VAP1非常重要.外源基因的插入对宿主菌的生长未产生明显的影响,重组质粒在毕赤酵母SMD1168中很稳定.     

基于rRNA基因ITS-1序列探讨扭蚌和反扭蚌的分类地位

测定并比较了扭蚌和反扭蚌的ITS-1序列，以三角帆蚌为外类群，利用Mega2．0软件中的最大简约法（MP法）和邻接法（NJ法）构建它们的系统发育树，试验结果表明，扭蚌和反扭蚌聚在一起形成一分支，三角帆蚌形成另一独立的分支；由此推断，扭蚌和反扭蚌属同物异名。     

黄芩苷对牙鲆肝CYP1A酶活性及基因表达的影响

本研究以中药黄芩苷为受试药物,研究其在不同剂量和作用时间下对牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝CYP1A酶活性和基因表达的影响。采用体内实验,将黄芩苷按低(50mg/kg·d)、中(100mg/kg·d)、高(200mg/kg·d)3个剂量分别口灌牙鲆,连续给药,并分别于给药3d、6d、9d后取样,测定CYP1A酶活性。结果表明,较空白组而言,给药3d,黄芩苷各剂量组鱼肝中EROD酶(CYP1A标志酶)活性没有明显变化(P0.05);给药6d,高剂量组的EROD酶活性极显著增加(P0.01),中剂量组的则显著增加(P0.05);给药9d,高、中剂量组的EROD酶活性均极显著增加(P0.01),低剂量组的EROD酶活性显著增加(P0.05),且黄芩苷对该酶的诱导作用与剂量和药物作用时间均呈正相关。半定量RT-PCR结果表明,各药物剂量组的CYP1A基因表达水平都发生了上调,且这种表达上调的幅度同CYP1A酶的活性一样,随给药时间和剂量的增加而加强,提示黄芩苷作为诱导剂对CYP1A酶活性的作用机制可能与调控CYP1A的转录水平有关。     

软体动物疱疹病毒及其对贝类养殖产业的危害

中国是贝类养殖大国,30余年来,贝类养殖产量总体稳中有升,但部分贝类的养殖产业因疫病影响出现严重萎缩、甚至消失。20世纪90年代以来,中国多种双壳贝类和杂色鲍(Haliotis diversicolor supertexta)因感染疱疹病毒出现大规模死亡,成为近年来危害中国贝类养殖业的主要病原。经流行病学调查和病原鉴定,引起中国双壳贝类和杂色鲍死亡的疱疹病毒分别为牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)和鲍疱疹病毒(Haliotid herpesvirus 1,HaHV-1)。贝类疱疹病毒病不仅在中国发生,同时也在全球多个国家、地区传播和暴发,引起全球贝类养殖从业者和科研人员的广泛关注。多国学者从病毒特征、流行病学、诊断技术、生态防控和抗病育种等多个角度展开研究,以期减轻此类病毒对贝类产业造成的危害。大量科研力量的投入使OsHV-1和HaHV-1成为分类地位明确,研究最深入、最全面的贝类病毒性病原。本文对近年来OsHV-1和HaHV-1研究领域取得的主要成果进行总结,重点介绍其在中国和全球范围的发生、传播过程、产业危害和防控措施等。     

集约化养殖最佳放苗密度的确定

运用西方经济学理论研究集约化养殖的最佳放养密度，关键在于建立养殖对象的生产函数。精养生产方式，把“高投入，高产出”作为评价获取“高效益”的标准有一定片面性。生产函数能提供各种优化方案，边际产量方程则揭示了各个生产要素与市场间的依存关系。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A/Goose/XJYL/10/2003HA基因的克隆和序列测定与分析

根据已发表的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因全序列,设计了1对引物,对禽流感病毒新疆株A/Goose/XJYL/10/2003(H5N1)提取RNA,经RT-PCR扩增后将其克隆到pMD18-T载体上,获得长为1758bp的HA全基因序列。序列测定后,分析结果表明,本试验株与广东、香港和东南亚等不同地区的H5N1禽流感病毒HA的核甘酸序列的同源率很高,其氨基酸切割位点附近具有高致病性禽流感病毒的特征。系统进化树分析表明,新疆株为独立分支,属于欧亚种系。     

基于GM(1,1)模型对垦区奶牛生产发展的预测

介绍了灰色理论GM(1,1)预测方法,利用黑龙江垦区2002~2005年年末奶牛存栏数建立了垦区奶牛生产发展预测模型。模型精度为很好,用该模型进行预测,能反映出垦区奶牛生产的发展变化情况,并基于预测分析对垦区奶牛发展提出建议和对策。     

重组酶快速检测十足目虹彩病毒1方法的建立

为建立十足目虹彩病毒1的快速检测方法,根据十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(ORF114R)保守序列设计特异性引物,通过条件优化,建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒1检测方法。重组酶聚合酶扩增技术的最优扩增温度为30 ℃,恒温反应20 min内即可完成。特异性试验结果显示,该方法与其他常见虾类感染病毒无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法对十足目虹彩病毒1的最低检出限为7 拷贝/μL,低于传统的巢式PCR方法。利用已建立的重组酶聚合酶扩增技术方法和PCR方法对采集的509批临床样品进行检测,试验结果表明,重组酶聚合酶扩增技术能够有效检出PCR方法的弱阳性样品,表明重组酶聚合酶扩增技术可以用于临床检测。笔者建立的检测十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术具有快速、简便、特异性强、灵敏度高的特点,适合基层实验室及现场检测。