慈竹4CL基因的克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆慈竹木质素生物合成酶4CL基因,研究其序列特征,为今后利用该基因调控慈竹木质素的生物合成研究奠定基础。【方法】参照其他物种4CL基因保守区,设计简并引物,以慈竹幼笋cDNA为模板,克隆到1条750 bp的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全长序列,并对其进行了生物信息学分析。【结果】成功克隆了慈竹4CL基因全序列,该序列CDS区全长为1 674 bp,编码558个氨基酸;氨基酸序列中存在两大4CL氨基酸保守域(SSGTTGMPKGV和GEICIRG),其中前一个氨基酸保守域的第7个氨基酸位点变为M,与常见的L不同,表明慈竹的4CL基因发生了一定变异。系统进化分析表明,该基因(Na4CL)与水稻的Os4CL4和黑麦草的Lp4CL2具有很高的同源性。【结论】克隆了慈竹木质素合成酶4CL基因全长序列,在GenBank上注册为EU327341,可能与慈竹木质素生物合成有关。     

银杏4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆与序列分析

根据银杏(Ginkgo biloba L.)转录组中的基因序列设计引物,从银杏中克隆到了4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)的cDNA片段,命名为Gb4CL,GenBank登录号为KU820947。Gb4CL全长1736bp,含有1个1671bp的ORF,编码557个氨基酸。核苷酸和蛋白质序列多重比较结果显示,Gb4CL与其他植物的4CL基因的核苷酸与蛋白质序列均高度同源。Gb4CL编码的蛋白质与日本柳杉(Cryptomeria japonica)、白豆杉(Pseudotaxus chienii)、北美云杉(Picea sitchensis)的4CL氨基酸同源性分别为82%、83%、80%。4CL系统进化树显示,Gb4CL与裸子植物亲缘关系最近。该研究通过克隆Gb4CL基因,并进行相关的生物信息学分析,可为掌握银杏木质素生物合成中关键基因的调控机理提供参考。     

石蒜捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆和序列分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约350bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的石蒜全长cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析对阳性克隆进行测序分析验证,克隆了石蒜中1个Cab基因全长cDNA,命名为LrCab(GenBank 登记号:GU362887).LrCab长为1073 bp,从第50 bp开始至847bp含有1个开放阅读框和1个终止密码子,编码 265个氨基酸.LrCab编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5.14和28 010.00 u.通过比较分析,LrCab DNA序列(GU362887)和编码的氨基酸序列与其他种属的Cab基因编码氨基酸序列相似性很高,表明Cab家族基因在进化过程中保守性高.     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA,cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3368bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长2967bp,共编码988个氨基酸,氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较。     

紫稻型水稻线粒体cox Ⅲ基因转录本的RNA编辑

紫稻细胞质雄性不育系是本实验室构建的新型细胞质雄性不育系.使用PCR、RT-PCR、DNA测序等技术.得到了紫稻细胞质雄性不育水稻不育系(樱香A)及其保持系(樱香B)线粒体细胞色素C氧化酶亚基cox Ⅲ基因转录本cDNA序列.通过与水稻"93-11"线粒体基因组序列比对发现,樱香A cox Ⅲ cDNA序列中.没有发生RNA编辑;而樱香B cox Ⅲ cDNA序列中有13个编辑位点,11个为C-T编辑,2个为T-C编辑.在樱香B cDNA序列中的13个编辑位点位于13个密码子中,所编码的氨基酸有10个发生改变.这些氨基酸的改变大大增加了蛋白质的疏水性.研究表明,RNA编辑在合成具正常功能的COX Ⅲ多肽的过程中具有至关重要的作用.同时也说明RNA编辑可能与细胞质雄性不育相关.     

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和［LVI］-［AGT］-［RKE］-［FY］-［AS］-［VI］-［EDQV］-［HYFQ］序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.      

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。     

条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析(英文)

利用已知甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特征性保守区域合成探针,并对条斑紫菜cDNA文库进行筛选,获得了一个编码叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)的全长cDNA克隆(GAP4)。GAP4包含了全长的叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列,编码72个氨基酸的信号肽和338个氨基酸的成熟蛋白。将获得的GapA蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后,发现条斑紫菜的GapA氨基酸序列都包含了4个高度保守的结构域。条斑紫菜GapA的cDNA序列中GC含量很高(64.2％),与紫菜EST分析中得到的结果(65.2％)近似。通过GAPDH的分子系统发育分析,对红藻的分类地位进行了初步探讨。条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库,序列号为:AY273819。     

条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析

利用已知甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特征性保守区域合成探针,并对条斑紫菜cDNA文库进行筛选,获得了一个编码叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)的全长cDNA克隆(GAP4)。GAP4包含了全长的叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列,编码72个氨基酸的信号肽和338个氨基酸的成熟蛋白。将获得的GapA蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后,发现条斑紫菜的GapA氨基酸序列都包含了4个高度保守的结构域。条斑紫菜GapA的cDNA序列中GC含量很高(64.2％),与紫菜EST分析中得到的结果(65.2％)近似。通过GAPDH的分子系统发育分析,对红藻的分类地位进行了初步探讨。条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库,序列号为:AY273819。     

鲮胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的分子克隆和序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从鲮肝脏总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因，克隆至质粒PUGm-T。测定该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆的鲮IGF-IcDNA编码序列包括信号肽、B、C、A、D和E6个区域，共161个氨基酸残基。与鲤IGF-I比较，信号肽由44个氨基酸残基组成比鲤少17个，成熟肽核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.2%和100%,E区域分析结果表明，克隆的鲮IGF-I序列属于IGF-I Ea-2亚型。     

鲮胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的分子克隆和序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从鲮肝脏总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因，克隆至质粒PUGm-T。测定该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆的鲮IGF-IcDNA编码序列包括信号肽、B、C、A、D和E6个区域，共161个氨基酸残基。与鲤IGF-I比较，信号肽由44个氨基酸残基组成比鲤少17个，成熟肽核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.2%和100%,E区域分析结果表明，克隆的鲮IGF-I序列属于IGF-I Ea-2亚型。     

猪骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及序列分析

克隆猪骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽基因。通过提取猪肾的总RNA,通过RT-PCR技术扩增出目的基因,并将其回收后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,进行阳性克隆的筛选与鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物,显示结果与预期片段大小一致,质粒PCR检测、酶切鉴定证实重组克隆中插入了PCR产物,测序结果揭示BMP-4成熟肽cDNA长为351bp,编码116个氨基酸。序列对比表明,猪与人、小鼠、牛、绵羊BMP-4成熟肽cDNA序列的同源性分别为94.87%、90.60%、94.87%、94.59%,而相应的氨基酸同源性分别为99.12%,99.12%,100%、100%。首次成功地克隆了猪BMP-4成熟肽编码基因,对于进一步研究猪BMP-4全基因结构、功能及其与繁殖性能的关系有重要的意义。     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

烟曲霉脱乙酰几丁质酶cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

将烟曲霉的一种胞外脱乙酰几丁质酶（AF CSN）纯化,并测定该酶N-端氨基酸的序列。用此序列推测的寡核苷酸引物扩增得到脱乙酰几丁质酶（csn）的cDNA,其全长为804bp,编码一种251个氨基酸的单肽,对csn的序列比较分析表明,它与茄病镰刀菌在两个区域具有同源性,这两个区域分别有重复天冬氨酸及苏氨酸残基,这说明它与细菌具有相同的演化起源。cns与已知的细菌脱乙酰几丁质酶没有同源性,Southern杂交分析显示,cns在烟曲霉基因组中的单拷贝的。用质粒栽体pET28a(t),csn cDNA被导入E.coli中得到csn的融合蛋白,在IPTG诱导下,E.coli细胞中可获得大量的约28kDa的成熟蛋白。     

东亚钳蝎神经毒素基因BmKCT的克隆与表达

从蝎毒腺中提取总RNA,通过RT-PCR得到东亚钳蝎神经毒素BmKCT的cDNA,将其连接到pUCm-T载体中。序列分析表明,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中24个为信号肽,其余35个为成熟肽,与Genebank上登录的相同。将蝎神经毒素cDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTrcHisA表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导可高效表达分子质量为10ku左右的融合蛋白。表达产物约占菌体总蛋白的25%。     

八角莲肉桂醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

鬼臼毒素是八角莲的重要药效成分。利用同源克隆和RACE的方法,从八角莲的根中克隆了鬼臼毒素生物合成途径肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因,长1 098 bp,编码由365个残基组成的氨基酸序列。八角莲CAD蛋白不含有质体定位的信号序列,与毛白杨(Populus tomentosa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中CAD蛋白的一致性为67.25%;系统发育分析表明,它与拟南芥的At CAD7、At CAD8和AtCAD6蛋白亲缘关系较近,聚成一个簇。组织表达分析结果表明,八角莲CAD基因在根和茎中有表达,而叶片中表达不明显。本研究获得的CAD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于鬼臼毒素的遗传调控,奠定了基础。     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

水稻盐胁迫相关基因sos5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%。     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。