巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124 bp的5'端非编码区,337 bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框.该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SK2类脱水素蛋白.命名为H6DDHN1,与其它植物的SK2类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性.RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达.     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

夜来香SAMT基因的分离与原核表达

为探究夜来香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代谢中的调控作用,以花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合,克隆夜来香SAMT基因的全长cDNA。结果表明：该cDNA的序列长度为1 493 bp,编码365个氨基酸,其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR,将其命名为CnSAMT;生物信息学分析结果表明：该基因所编码的氨基酸序列与烟草、番茄的同源性分别为98％和98％,属于甲基转移酶-7家族;原核表达结果表明：CnSAMT的蛋白表达产物约为42 ku,与软件预测的结果大致相同。采用染色体步移技术,克隆夜来香CnSAMT的5′端调控序列,结果表明：该序列长度为993 bp,且该序列除了含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件外,还含有光、生长素、脱落酸、热胁迫、缺氧胁迫等外界环境条件响应的顺式作用元件。     

木榄质膜型Na+/H+逆向转运蛋白的基因克隆与序列分析

根据已发表的胡杨、毛白杨、蓖麻、番杏、番茄、盐角草等逆向转运蛋白基因的保守区设计兼并引物,通过RT-PCR和RACE技术,从木榄(Bruguiera gymnorrhiza)中克隆出Na+/H+逆转运蛋白的cDNA全长序列,长度为3 703 bp,其中,开放阅读框3 462 bp,编码1 154个氨基酸,含12个跨膜区。序列同源性分析表明,该氨基酸序列与毛果杨、蓖麻、胡杨、葡萄等Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列具有很高的同源性(70%以上),表明该序列确属Na+/H+质膜型逆向转运蛋白的家族基因。     

大豆对羟苯丙酮酸双加氧酶基因的克隆与表达分析

采用电子克隆与实验克隆结合的方法获得了大豆对羟苯丙酮酸双加氧酶基因的cDNA序列,GenBank登录号为EF608178.利用多种生物信息学工具分析了该cDNA序列及其编码的蛋白质序列,分析了其启动子特征和电子表达谱.结果表明:该cDNA序列含有1个编码443个氨基酸的完整的开放读码框,3'端具有2个加尾信号和polyA尾巴.启动子区除含有通用核心元件外,还含有许多与光反应有关的作用元件;不同物种之间对羟苯丙酮酸双加氧酶的氨基酸序列同源性较高;该基因在光合作用和贮藏器官中的表达量高.     

甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析

△~1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶.应用同源性克隆结合RACE技术获得甘蔗PSCS基因cDNA全长序列2714bp,其中5'端非编码区为226bp,3'端非编码区340bp,poly(A)上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA;开放读码框为2 148 bp编码715个氨基酸,含双功能域;其编码的蛋白分子量为77.7 ku,等电点为6.47.序列比对分析结果表明,P5CS基因的4个主要功能区(domain)中亮氨酸功能区(Leucine domain)相对不保守,其它功能区均较为保守.对17个物种的P5CS基因进行聚类分析,结果与公认的生物学分类及进化关系吻合.对甘蔗P5CS在根、茎、叶的表达进行实时PCR分析,结果表明,该基因在茎、叶表达量相近,但在根的表达量极低.     

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆与序列分析

对多种已知植物巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的氨基酸序列进行比对分析,根据其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物,并从茶树品种龙井43鲜叶中提取总RNA,用RT-PCR法扩增出一204bp的cDNA特异片段,然后通过3’/5’RACE的方法,分别扩增出3’端和5’端的序列,从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列,所得序列全长627bp,编码101个氨基酸,分子量约11.062KDa。该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的QXVXG结构,且经Blast分析表明,该基因序列与其他植物巯基蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列同源性为54%~77%。     

洋常春藤甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因 HhMVD 的克隆与表达 分析

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（Mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD）是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶, 为研究其在洋常春藤中的基因功能,通过 RT-PCR 和 RACE 技术从洋常春藤叶片中克隆获得 HhMVD 基因的 cDNA 全 长序列,并通过 RT-qPCR 技术分析其表达规律。结果表明：RACE 克隆获得的 HhMVD 基因 cDNA 序列全长 1 799 bp, 包含一个完整开放阅读框（ORF）1 263 bp、5′非编码区（5′UTR）192 bp、3′非编码区（3′UTR）344 bp;该基因编码 420 个氨基酸,分子质量 46.6 ku,理论等电点为 6.57,不含跨膜区,属于非分泌型蛋白;HhMVD 蛋白具有 GHMP 激 酶 N 端结构域,属于甲羟戊酸激酶系列,与刺五加、人参、三七等同科植物亲缘关系较近。RT-qPCR 结果表明,洋常 春藤中 HhMVD 基因的时空表达相对稳定,但与常春藤皂苷含量差异变化之间存在一定的负相关性。洋常春藤 HhMVD 基因的成功克隆及表达分析研究,为深入探讨其基因功能、阐明其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用提供理论依据。     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

花生中两个CBF-like基因全长的克隆与序列分析

DREB／CBF类转录因子的功能及作用机理在拟南芥、水稻等模式植物中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生eDNA文库中找到了15个可能编码CBF类蛋白的基因片段,其中有2个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5-RACERT-PCR对...     

茶树根系Actin基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得了Actin基因全长序列,Actin基因长1β606βbp (GenBank, 登录号KJ946252),具有1β131βbp开放阅读框（1^st~1β131^st）,编码377个氨基酸。分子生物信息学分析表明,Actin蛋白分子量约30.69βkD,等电点为5.27,定位于细胞核等亚细胞区位。研究还显示,Actin在不同品种中表达无显著差异,对非生物性胁迫响应也较弱。     

TaMBD2基因cDNA全长克隆及其在小麦叶片和种子中的表达

为探讨甲基结合蛋白(MBD)在小麦生长发育过程中的生物学功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因的cDNA全长,并分析了该基因在小麦叶片、种子发育及萌发过程中的表达特性。RACE克隆及序列分析表明,TaMBD2基因cDNA全长为1 511 bp,其中5 UTR 164 bp,3 UTR 405 bp,ORF 942 bp。对该基因编码氨基酸序列的分析发现,TaMBD2编码蛋白中包含有1个典型的甲基结合域和1个CW型锌指结构域;通过RT-PCR分析发现,TaMBD2基因在叶片中的表达随着小麦的生长发育而逐渐增强;在种子发育过程中,该基因在花后20和30 d时的表达量最高;在种子萌发过程的胚和胚乳中,该基因的表达水平变化不大。     

不同基因型大豆Fd-GOGAT基因cDNA序列的克隆与分析

克隆了6个不同基因型大豆的Fd-GOGAT基因,序列比对分析结果表明:不同基因型大豆的Fd-GOGAT基因序列相似性很高,可设计出通用Real-time PCR引物,检测Fd-GOGAT基因的表达规律.在东农42 Fd-GOGAT基因序列的编码区内出现了1个8核苷酸的缺失,产生了移码突变,导致其C端缺失了79个氨基酸的...     

烟草伤诱导型过氧化物酶基因(tpoxN1)启动子的克隆及分析

利用GenomeWalker的方法获得了烟草伤诱导过氧化物酶基因(tpoxN1)的5’调控序列,序列分析表明,烟草的tpoxN1基因的转录起始位点(tspA)的保守序列5’TCAATCA与其它植物基因非常一致,转录从tsp下游79bp处开始。在邻近5’区域,发现下列5个真核生物顺式调控元件:在-28bp处存在TATAbox序列(TATAAATATGT);在-66bp处具有TCCAAT序列,与众多高等真核生物的启动子的‘CAAT’相似;在-204,-749处发现有TCA-like序列;在-840处存在GC-box;在-1005处存在CCAAT-box。      

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal（AB002266）的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。