新型鸭肝炎病毒VP1基因的序列分析及其原核表达

参照已公布的新型鸭肝炎病毒(new type Duck hepatitis virus,N-DHV)基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法成功扩增出N-DHV FJ01株VP1基因,经克隆测序后得到全长为720 nt的FJ01株VP1基因序列。将所得测序结果用DNAstar软件包MegAligntkg程序进行序列比对分析表明,N-DHV FJ01株与GenBank登录的韩国病毒株的同源率为94.2%~98.9%,与台湾病毒株04G和90D的同源率仅分别为72.3%和72.5%,与DHV-1病毒株DHV-HS和DRL-62的同源率仅分别为70.8%和70.7%;通过系统进化树可以发现韩国型与台湾型鸭肝炎病毒可分为2小群。本研究同时将N-DHVVP1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP1基因已成功地在大肠杆菌中得以表达。     

种鹅源鸭甲肝病毒1型的分离鉴定及其VP1基因分析

从病死的朗德种鹅肝脏中分离到1株可致鸭胚死亡的病毒,该病毒无血凝活性,其基因可被鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)特异性引物所扩增,但不能被鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒特异性引物所识别,因此将其暂命名为种鹅源鸭甲肝病毒1型JX1405株。将该株VP1基因扩增产物回收后克隆,序列分析表明JX1405株与DHAV-1参考株的同源率高达91.6%~99.3%,与DHAV-2参考株的同源率较低,仅为69.4%,和DHAV-3参考株的同源率为71.2%~72.5%,遗传进化分析表明JX1405株与DHAV-1关系密切,它们在进化树中共处同一分支。     

鸿雁源鸭甲肝炎病毒Ⅰ型的分离与鉴定

为了对一起死亡率高达91．3％、急性死亡的鸿雁病例进行病原学分析,通过细菌分离排除法和病毒分离方法获得致鸭胚死亡病毒（暂命名为FJ-017株）。该病毒无血凝活性,用鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭甲肝炎病毒1型、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒特异引物分别进行扩增,电泳结果显示,仅鸭甲肝炎病毒1型引物可扩增出条带。将扩增产物回收后克隆,序列分析表明FJ-017株与22株DHAV-1参考株的同源率为93．5％-99％,而与DHAV-2和DHAV-3参考株的同源性均为79．9％。遗传进化分析表明FJ-017株与DHAV-1关系密切,在进化树中共处一分支,表明FJ-017株为鸭甲肝炎病毒1型,此为国内外首次报道。     

新型鸭肝炎病毒疫苗候选株的筛选

本试验对临床患病鸭分离的一株疑似鸭肝炎病毒进行了血清型鉴定和毒力测定。利用Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒鉴别引物对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;将分离病毒分别与Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒阳性血清进行中和试验;根据测定的病毒ELD50,进行雏鸭攻毒和鸭胚肝细胞接毒试验。结果表明:RT-PCR扩增出了与新型鸭肝炎病毒预期片段相符的705bp条带;分离病毒不能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和,新型鸭肝炎病毒阳性血清对该病毒的中和效价是1:200,说明该分离株属于新型鸭肝炎病毒。该毒株的ELD50为10-5.7/0.2mL,能引起攻毒鸭与临床病例一致的症状和病变以及显著的肝细胞病变,可作为新型鸭肝炎病毒的疫苗候选株开发应用。     

新型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的1型鸭病毒性肝炎(duck hepatitis virus type 1,DHV-1)和新型鸭病毒性肝炎(new type duck hepatitis virus,N-DHV)全基因序列,在非同源区域设计一对新型鸭病毒性肝炎特异性引物P1/P2,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒细胞毒、流感病毒等鸭常见病病原进行RT-PCR扩增.结果表明引物特异性良好,引物P1/P2仅能特异性扩增出N-DHV的638bp基因片段;敏感性试验结果表明:N-DHV RNA最低检出量为21 pg.同时对临床样品的检测中发现DHV-1和N-DHV存在混合感染的情况.该方法的建立为鸭病毒性肝炎病毒尤其是新型鸭病毒性肝炎病毒的鉴定及快速诊断提供了可靠的依据.     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列,应用PrimerPrimier5．0软件,在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物,成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带,从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带,设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒,特异性好;分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此,该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

利用I型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组的5′端UTR附近区域设计1对引物,以病死鸭肝组织悬液、鸭胚尿囊液毒和鸡胚尿囊液毒为模板,RT-PCR扩增得到336 bp基因片段。经测序分析病死鸭分离病毒与已发表鸭病毒性肝炎DHV-Ⅰ型病毒的基因同源性可达98%,该病毒与已知DHV-Ⅰ毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。为进一步验证所分离的病毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒,依据Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因特异性引物进行PCR,得到714 bp左右目的片段,证明该病毒为鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的基因序列,应用Oligo软件对DHV-1的保守基因3AB设计引物,以江西分离株(JXau-F)的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到预期大小的目的基因。通过对该方法的敏感性和特异性的检测,结果表明,建立的利用RT-PCR检测DHV-1的方法具有良好的敏感性和特异性。该法最低模板检测量为20 pg,且只能检测出DHV-1,对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒和健康的鸭肝组织均不能检出。克隆、测序证实了扩增基因的正确性。通过对临床病料检测结果表明,该方法可用于Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速鉴别诊断。     

Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒双重RT-PCR检测方法的建立与优化

为了快速鉴别诊断Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHV),根据NCBI中发表的DHV毒株序列设计2对特异性引物,针对西南大学荣昌校区疾病快速诊断中心保存的DHV-Ⅰ型和DHV-Ⅲ型毒株进行了RT-PCR双重检测方法的建立及条件的优化试验。结果表明:所建立的方法可同时对两种血清型的DHV分别扩增出440 bp和642 bp的特异性条带,灵敏性可以达到18.7×10-1ng/μL;利用该方法对鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鸭圆环病毒、番鸭细小病毒、鸭副黏病毒、新型鸭肝炎病毒进行扩增,扩增结果均为阴性。说明所建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,具有较高的灵敏性,可用于DHV-Ⅰ型和DHV-Ⅲ型的鉴别诊断。     

鸭 I 型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法.该方法对同一样品中的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的202 bp(鸭I型肝炎病毒)和474 bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到100 fg的鸭I型肝炎病毒RNA和番鸭细小病毒DNA.研究建立的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测.     

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h内完成;可以通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。实验结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DHV Ⅰ感染的快速检测。     

鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp（DHV）、264bp（AIV）和362bp（NDV）,且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

Dot-ELISA用于雏鸭病毒性肝炎的诊断

本实验采用过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记纯化的I型鸭肝炎病毒单克隆抗体,建立了检测DHV(鸭病毒性肝炎)的Dot-ELISA方法。该方法简便易行,特异性好,与鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒等无交叉反应,重复性高,对病毒尿囊液的最低检出范围为116,而对肝脏病料的最低检出范围为1160。该方法可用于临床发病鸭的检测。     

一株鸭肝炎病毒的分离与鉴定

从山东某养殖场送检的疑似鸭病毒性肝炎病料中分离到一株病毒（暂命名为SD株）,分别用鸭胚、雏鸭进行传代和病毒含量测定,E1-E8代鸭胚适应毒的ELD50在1015^-5.0-10^-6.0／0．1mL之间,E1、E2代鸭肝组织毒的LD50分别为10^-5.5／0．1mL、10^-6.7／0．1mL。动物回归试验结果表明,SD株鸭胚适应毒E2对4日龄雏鸭的致死率为100％;雏鸭毒力测定试验结果表明SD株雏鸭肝组织毒E,代对12日龄内雏鸭具有较高致死率,12日龄后随着日龄的增大,雏鸭的死亡率逐渐降低;理化特性鉴定结果表明,SD株为无囊膜病毒,对脂溶剂（乙醚和氯仿）、胰酶、酸、热均不敏感,且无血凝性。血清交叉中和试验和交叉保护试验结果表明,在血清型上,SD株与DHV-1无关。通过对SD株与韩国N-DHVVP1基因的序列比对和进化树分析,发现二者同源性在99％以上。结果证实,SD株是新型鸭病毒性肝炎病毒,而不是DHV-1。     

鸭疱疹病毒1型套式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速鸭疱疹病毒1型(Anatid herpesvirus 1,AHV-1),又名鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的DEV基因序列,设计合成内、外2对引物,建立了检测DEV的套式PCR方法。该方法对正常鸭胚、健康鸭肝肠组织、鸡传染性喉气管炎病毒、伪狂犬病病毒、减蛋综合征病毒、鸭肝炎病毒和新城疫病毒的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是10 ng,第2次扩增的敏感性是0.1 ng,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。建立的套式PCR方法具有良好的特异性、敏感性,可以准确快速检测出极低含量的DEV,将为鸭病毒性肠炎的病原检测及分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的检测方法。     

鸭肝炎病毒GD-B株生物学特性测定及多聚蛋白基因序列分析

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法分段扩增鸭肝炎病毒GD-B株多聚蛋白基因并克隆测序,构建多聚蛋白核苷酸系统进化树,并测定GD-B株部分生物学特性.结果表明,GD-B株多聚蛋白基因核苷酸序列与DHV-Ⅰ型GFS99广东株同源性最高(99.5％),属Ⅰ型鸭肝炎病毒,其EID50...     

番鸭呼肠孤病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上发表的鸭呼肠孤病毒基因组序列,利用生物学软件设计合成内外2对引物,建立了检测番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的套式RT-PCR检测方法,并运用建立的检测方法对分离病毒与其他禽病病毒进行检测。结果显示,该方法能从MDRV中扩增到与预期大小相符的特异性目的片段,检测灵敏度达到0.1 pg病毒RNA,对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)等病毒样品的扩增结果均为阴性。因此,本研究为番鸭呼肠孤病毒病的快速检测及诊断研究提供参考。