南果梨茎尖离体快繁技术研究

为了探索一种南果梨离体培养快速繁殖的方法,以南国梨茎尖为材料,以MS基本培养基添加6-BA、NAA、IBA进行离体培养及再生体系研究。结果表明最适取材时间为4月上旬;最佳预处理为GA3 0.1 mg/L预处理一周;最佳灭菌时间为0.1% HgCl2溶液灭菌8~10 min;不同品种的南果梨茎尖增殖和生长能力不同;‘大红南果梨’的最适继代培养基为：MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L;IBA促进生根,最适生根培养基为1/2MS+IBA 1.4 mg/L,GA3抑制生根;试管苗移栽的最适基质为珍珠岩:草炭土:河沙=1:1:1,成活率可达93.3%。     

不同基因型甘蔗甘露糖抗性筛选体系的建立

为明确不同基因型甘蔗再生过程中对甘露糖的敏感性,为甘蔗基因工程育种中转化子的离体筛选提供技术。使用甘露糖作为筛选底物,对甘蔗品种‘ROC22’、‘桂糖94-119’和‘桂糖96-44’外植体的再生进行研究。建立3个基因型甘蔗的甘露糖抗性筛选体系,在甘蔗愈伤组织继代增殖、分化和小苗生根3个阶段进行抗性筛选时,甘露糖占总糖的比例分别是60%、60%~70%和30%。通过统计分析,明确了不同再生阶段甘露糖对3个甘蔗基因型的影响不同,继代增殖阶段基因型间无明显差异,但在分化和生根阶段达极显著差异。     

以茎尖分生组织为受体用农杆菌介导法转化激发子基因pemG1棉花植株的获得

为了解决棉花常规遗传育种周期长,农杆菌介导的转化下胚轴再生难,转化率低,胚变异率高等难题。通过改善茎尖的遗传转化,利用农杆菌介导法转化棉花茎尖,试图缩短转化周期,获得转化苗。构建了稻瘟菌激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-pemG1,分别以‘珂字312’、‘中棉24’棉花茎尖分生组织作为外植体,摸索无菌苗的最佳培养方案,确定最佳共培养温度、共培养时间及卡那霉素筛选浓度。经过共培养,茎尖在诱导芽培养基上诱导生芽,从不同浓度的BAP和NAA生长激素的组合中,最终确定0.1 mg/L的BAP和NAA最适合芽的诱导;经过两个月的继代培养,在含有GA3的茎增殖培养基上完成茎的增殖和延伸;切取幼芽并使其在含有0.1 mg/L的IBA生根培养基中生根;生根的抗性植株移栽到温室中成苗,获得了T0代转基因株系4株。进行了转pemG1阳性植株的初步验证。     

植物生长调节剂对苹果组培苗延缓生长保存的效应

以富士、乔纳金、金矮生、嘎拉组培苗为试材,在继代培养基中加入不同浓度的比久、矮壮素、多效唑及脱落酸,研究了植物生长延缓剂和生长抑制剂对苹果组培苗延缓生长种质保存的效应。结果表明：比久、矮壮素均有明显抑制苹果组培苗生长的作用,且茎尖存活率高,试管苗生长状况较好,转入常规继代培养基当代即可恢复生长,可用于苹果种质资源的离体保存,比久适宜的浓度为80mg/L,矮壮素为75mg/L左右;多效唑处理虽能明显抑制苹果试管苗生长,但易使有些品种试管苗玻璃化,可选择性应用;脱落酸作用过于剧烈,绝大部分处理苗死亡,不宜在苹果种质保存中使用。     

番茄组培再生体系优化研究

对番茄再生体系中无菌苗的苗龄、不定芽诱导培养基和生根培养基的激素配比进行了优化。试验以‘浙杂905’、‘圣亚’和‘富丹’为材料。用番茄的茎段和子叶作为外植体,对外植体的出愈率、诱导率和不定芽生根情况进行差异比较。主要结果如下：选苗龄为4天的番茄幼苗。番茄子叶为外植体的最佳再生培养基配比为MSB5+3%蔗糖+0.6%琼脂+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（pH5.8）,‘浙杂905’、‘圣亚’和‘富丹’子叶的出愈率分别为97.00%、91.00%、86.00%,诱导率分别为64.67%、59%、53%。以番茄茎段为外植体的最佳再生培养基配比为MSB5+3%蔗糖+0.6%琼脂+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L（pH5.8）,‘浙杂905’、‘圣亚’和‘富丹’茎段的出愈率分别为81.67%、76.00%、82.67%,诱导率分别为41.00%、48.67%、39.67%。不定芽生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L +IBA 0.5 mg/L。通过试验对比得出,番茄再生体系中选用无菌苗的最佳苗龄、不定芽诱导培养基和生根培养基的配比,子叶的再生能力要显著高于茎段。     

保存多年苹果试管苗端粒酶活性具有相对稳定性

为明确苹果端粒酶特性与组培试管苗繁殖、衰老的关系,本试验选取‘金冠‘’富士’及‘嘎拉’3个苹果品种的不同继代次数、不同苗龄的试管苗叶片及不同的试管材料(试管苗叶片,茎段,愈伤组织),分别用改良TRAP法和实时荧光定量PCR法测定了端粒酶活性和端粒酶逆转录酶基因表达量。研究表明,随继代次数增加,保存多年的苹果试管苗端粒酶活性变化不显著;苹果试管苗在90 d的生长期内,不同苗龄叶片端粒酶活性呈现先升高后降低的趋势;不同试管材料端粒酶活性具有组织特异性,其中‘金冠’愈伤组织端粒酶活性最高,‘嘎拉’叶片的端粒酶活性最高。本研究中端粒酶逆转录酶基因表达量与端粒酶活性的变化规律一致。     

甘薯叶片和叶柄组织诱导培养及植株再生研究

为探索甘薯叶片和叶柄组织诱导和植株再生技术,应用甘薯优良品种‘万薯7号’叶片、叶柄在7个诱导培养基中的离体培养。试验表明,‘万薯7号’叶片和叶柄在本试验的7个诱导培养基中,极易诱导产生愈伤组织,诱导率达100%。叶片和叶柄在经培养基MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L IAA诱导出绿色愈伤组织后,在继代培养基MS+4.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培养15天后,均诱导成苗。     

避雨栽培对苹果叶片生长的影响

为了探讨避雨栽培对苹果叶片生长的影响,以11年生‘富士’苹果(Malus domestica Borkh. ‘Fuji’)和11年生‘金冠’苹果(Malus pumila Mill. ‘Golden Delicious’)为试材,采用避雨栽培的方法,研究避雨栽培对叶片生长发育的影响。结果表明：避雨栽培‘金冠’苹果叶片比露地栽培的叶片厚,但没有显著性差异。避雨设施降低光照强度,叶片中叶绿素含量避雨栽培高于露地栽培;叶片矿质元素锌、钾、锰、镁、磷和铜元素含量是避雨栽培比露地栽培高,铁和钙元素含量与之相反;光合相关基因psaB、psbA、psbD、RA、atpB的表达有所差别,以atpB基因最为明显,它仅在避雨栽培条件下表达,而psbA表达基本不受栽培方式的影响。试验结果为苹果避雨栽培的应用提供了重要的依据。     

姜薯高效离体再生体系的建立

为建立姜薯的高效离体再生体系,以姜薯的侧枝茎节为外植体,对影响植株离体再生的关键因素进行研究。结果表明,外植体最佳灭菌方式为75%乙醇消毒30s,结合0.1%升汞(加数滴吐温-20)浸泡11min;最佳初代芽诱导培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA,诱导率达80.0%;最佳继代增殖培养基为MS+1.2mg/L 6-BA,增殖系数达2.15;最适生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L IBA+0.3g/L AC,培养30、50d后生根率分别达84.4%和98.9%;试管苗移栽于基质(珍珠岩:椰糠=1:1)后的成活率达80.0%以上;组培苗种植于大田,生长健壮,成功结薯。以侧枝茎节为外植体,经腋芽增殖,建立了姜薯高效离体再生体系,为姜薯的良种快繁、种质资源保存和品种改良打下了基础。     

苹果休眠茎尖的超低温保存研究

苹果金冠品种的休眠芭尖经３种不同方法超低温保存后,均获得成功,存活率达到８３％。休眠茎尖经受了冬季的深冷驯化和具有较低的含水量,因而成为超低温保存的良好试材。经过玻璃化液（ＶＳ３：５０％甘油＋５０％蔗糖）预处理８０ｍｉｎ后或经蔗糖溶液预培养产于无菌空气中干燥脱水至含水量３０％左右后,休眠茎尖可直接投入液氮进行超低温保存。保存一的休眠茎尖经离体２后可直接再生植株。试验进一步验证了试材生理状态的选择是     

非洲菊离体叶培养诱导不定芽研究

为探寻非洲菊离体叶片培养的不定芽再生条件,完善非洲菊离体叶片的不定芽再生体系,以不同解离方式（叶自株丛基部撕脱、叶自株丛基部剪切、叶柄剪半）的离体叶为外植体,进行不同激素浓度配比的试验。结果表明,除叶柄剪半的外植体无不定芽再生外,另2种离体叶在叶柄基部均有器官型再生不定芽和器官发生型再生不定芽。自株丛基部撕脱的离体叶于1/2MS+KT 5 mg/L +NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L的培养基中,器官型不定芽的直接再生率最高达60%~70%。再生比例为1~2,器官发生型再生率20%~30%,再生比例1~2。器官型不定芽再生主要集中在接种后4~12天的时间段内,而器官发生型不定芽形成主要集中在接种后12~24天的时间段内。若将KT换成BA的不同浓度,则仍以自株丛基部撕脱离体叶的器官型再生率最高达60%~70%,再生比例4~5,器官发生型再生率为50%~60%,再生比例为2~3。试验表明：BA和KT二者同属细胞分裂素类物质,二者浓度上的变化对不定芽再生影响不大,而二者种类不同对不定芽再生差异很大。     

‘蕲山药’离体再生及试管微块茎的形成

为解决生产上‘蕲山药’脱毒种药供不应求的问题,以其茎节为试验材料,研究不同植物生长调节剂配比对‘蕲山药’不定芽再生的影响以及不同碳源对试管微块茎形成的影响,建立‘蕲山药’的离体再生体系及高效形成试管微块茎的方法。结果表明,在不同植物生长调节剂配比对‘蕲山药’诱导不定芽分化的影响中,MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L或MS+ ZT 0.2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L对‘蕲山药’不定芽分化较好,形成不定芽频率分别达到81.33%、82.67%;MS+ 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.02 mg/L对‘蕲山药’不定芽增殖效果最好,增殖系数高达4.7;MS+ NAA 0.02 mg/L适合‘蕲山药’不定芽生根,生根率高达96.32%。150 mg/L PVP能有效降低‘蕲山药’组织培养的褐化现象。试验还发现,MS+ BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+ 60 g/L蔗糖,最有利于‘蕲山药’试管微块茎的形成与生长,其微块茎形成率最高,达到了97.50%;其60、120天微块茎质量分别达到了0.18 g和0.39 g。     

沙田柚遗传转化再生体系的建立

以沙田柚的实生苗不同外植体为对象,进行了沙田柚遗传转化再生体系建立研究。研究结果表明：以实生苗上胚轴作为外植体,以MS无机盐＋100 mg/L肌醇＋0.2 mg/L维生素B1+1 mg/L维生素B6+1 mg/L烟酸+3％蔗糖＋0.8％琼脂（pH5.8）＋5 mg/L 6-BA为不定芽诱导培养基,暗培养7 d后,转移至光/暗周期16/8 h的条件下培养,不定芽的分化率高达91.1%;不定芽在1/2MS基本培养基＋3％蔗糖＋0.7％琼脂＋1.5 mg/L IBA＋0.2%活性炭的生根培养基,生根率高达80％;以卡那霉素作选择剂时,选择浓度为50mg/L。     

‘北林雄株1号’和‘北林雄株2号’叶片再生体系的建立

为了解决白杨杂种三倍体‘北林雄株1号’和‘北林雄株2号’无性繁殖困难问题,以白杨杂种三倍体‘北林雄株1号’和‘北林雄株2号’的半木质化嫩枝为材料,对外植体消毒方法以及不同激素组合对叶片诱导不定芽的效果进行研究。结果表明：（1） ‘北林雄株1号’和‘北林雄株2号’启动培养最佳的消毒处理方法为20%浓度的84消毒液处理20 min;（2）激素6-BA以及TDZ对‘北林雄株1号’叶片不定芽再生率以及再生系数的影响显著,NAA对叶片不定芽再生率影响不显著,对再生系数的影响极显著,筛选出‘北林雄株1号’叶片再生的适宜培养基为MS+ 0.2 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA+ 0.005 mg/L TDZ;（3）激素6-BA、NAA以及ZT对‘北林雄株2号’叶片再生率和再生系数的影响均达到了显著水平,筛选出‘北林雄株2号’叶片再生的适宜培养基为MS+ 1.0 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA+ 1.2 mg/L ZT。‘北林雄株1号’与‘北林雄株2号’高效叶片再生技术体系建立,为该品种的规模化无性繁殖以及后续的基因工程育种等研究提供了技术基础。     

4个优良石榴品种叶片高频再生体系的建立

为提高石榴叶片再生率,增加再生芽数量及缩短再生周期,以‘泰山红’‘、泰山三白甜’‘、皮亚曼’‘、牡丹’4个石榴品种盆栽苗和无菌苗叶片为试材,研究培养基类型、生长调节剂配比、叶片来源和培养步骤对不定芽再生的影响。结果表明：MS是叶片再生最适培养基类型;无菌苗叶片比盆栽苗叶片更易再生不定芽;BA3.0mg/L+KT1.0mg/L+IBA0.3mg/L是叶片愈伤组织诱导、分化和不定芽形成过程中生长调节剂最佳配比;先在液体培养基上培养3~5天,再转至固体培养基比仅在固体培养基上效果更好,叶片再生率最高达98.47%,出芽数达7.51个。叶片不定芽的最佳单芽培养基和增殖培养基分别为B5+BA0.6mg/L+IBA0.5mg/L+椰汁100mL/L+PVP2.0g/L+GA31.0mg/L和B5+BA0.8mg/L+IBA0.5mg/L+椰汁100mL/L+PVP2.0g/L,增殖系数为5.56。适宜的生根培养基为B5+IBA1.0mg/L+椰汁100mL/L,生根率为89.63%。由此建立了石榴叶片高频再生体系。     

Spontaneous induction of tetraploidy in hop using adventitious shoot regeneration method

In the process of breeding triploid hop cultivars, diploid varieties need to be raised to the tetraploid level. Existing methods are predominantly based on treatment of the apices with antimitotic substances, in vivo or in vitro , resulting in a reported maximum of 26% tetraploids and a large proportion (over 60%) of mixoploids. This study was set-up to test whether an adventitious shoot regeneration protocol can be used as an alternative. In the first part of the experiments, regeneration media and a choice of explants (internodes, petioles and leaf discs) were optimized using three hop cultivars with putatively low, medium or high adventitious shoot regeneration capacity. On an optimized induction medium supplemented with 6 mg/l N ⁶-(2-isopentenyl) adenine (2iP), a regeneration rate up to 17.7% was obtained from cultured internodes, even of the most recalcitrant 'Aurora', while the regeneration rate of the most responsive 'Tettnanger' was 56.9%. Flow cytometric analysis of ploidy level revealed a high frequency of tetraploid induction, the highest (58.6%) being in 'Savinjski golding'. In 616 regenerants of all three cultivars, 30.4% were found to be tetraploid, the others were diploid. Cytokinin content was found to be of minor importance in tetraploid induction. The high frequency of spontaneous tetraploid induction and, in particular, the complete absence of mixoploids makes this protocol an alternative to the currently established methods of chromosome doubling based on the use of antimitotic substances. The occurrence of a high proportion of tetraploid adventitious regenerants in hop is discussed in view of certain other biotechnological applications.     

人参果‘长丽’叶片再生体系的建立

为了建立人参果遗传转化再生体系,以‘长丽’品种试管苗叶片为材料,研究了培养基种类、pH对人参果试管苗生长和激素组合对人参果叶片不定芽再生的影响。结果表明：培养基pH 5.7~6.0时,MS培养基有利于人参果试管苗的生长,培养24天时平均株高达8.5 cm;GS培养基有利于试管苗生根,培养24天试管苗的生根量达到13.8个/株。6-BA与TDZ配合使用,可显著提高叶片不定芽的再分化能力,在MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L培养基上叶片的再分化率达到83.3%,再分化系数达8.5。本试验研究发现人参果叶片不定芽再生的适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L。     

白术叶片再生植株和丛生芽快繁的研究

白术是菊科的一种重要药用植物。为满足白术的药用需求，扩大其资源供应，避免传统开荒育苗种植模式对生态环境的破坏，为白术的大规模工厂化育苗及获取药用次生代谢产物提供有效的途径和方法，笔者以白术叶片为外植体经愈伤组织再生植株和丛生芽增殖两种方式建立了白术无菌苗的快速繁殖技术，分析了不同植物激素种类和浓度对白术叶片再生植株及丛生芽增殖的影响，研究了温度和光照条件对白术叶片愈伤组织褐变的影响。研究结果显示在培养基MS+ 6-BA1 mg/L+NAA0.2 mg/L上白术丛生芽增殖倍数最高，可达4.45倍；以白术的叶片愈伤组织诱导及再生植株的最佳培养基为MS +KT 1mg/L+NAA0.2 mg/L，愈伤组织诱导率可达96.7%；芽分化率为90%。不同的细胞分裂素种类与浓度处理差异显著，在白术叶片的愈伤组织诱导中，KT的效果要优于6-BA，但在丛生芽增殖中则表现出高浓度的6-BA要优于KT。白术叶片愈伤组织继代培养中褐变程度与温度、光照条件有关，1000 lx光照强度，20±0.5℃的温度条件下继代培养能有效控制褐变。     

葡萄叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

本研究以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗为试材,研究了卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）对葡萄离体叶片再生的影响,以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。试验结果表明葡萄继代苗对Hyg的敏感性强于Kan,葡萄遗传转化更适合使用潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。Hyg 3.0mg/L即达到继代苗致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度,Hyg 0.8mg/L完全抑制叶片不定芽的分化,可作为叶盘法转化时抗性芽的选择压。葡萄叶盘法基因转化中抑制农杆菌生长的抗生素可选用Cef 300mg/L或Carb 400mg/L,但对不定芽的分化有抑制作用。     

‘黑珍珠’番茄植株再生体系的研究

为了研究‘黑珍珠’番茄植株再生,以‘黑珍珠’番茄幼嫩叶片为外植体诱导愈伤组织,通过愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、不定芽增殖培养、生根培养和试管苗移栽,建立高效快速的‘黑珍珠’番茄再生体系。结果表明：最适宜的诱导叶片愈伤组织的培养基为MS+ 1.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA,叶片外植体愈伤组织诱导率最高可达98.2%;诱导出的愈伤组织在MS+ 1.5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L IBA培养基上能很好的分化出不定芽;MS+4.0 mg/L KT+ 0.01 mg/L IBA 培养基可实现不定芽芽增殖;最适宜的生根培养基为1/2MS+ (0.05~0.08) mg/L NAA,试管苗移栽成活率达92%。